Estudio sobre biosíntesis de Mogroside V

Los edulcorantes selun tipo deaditivo alimentario. Se pueden dividir en edulcorantes sintéticos y edulcorantes naturales según su origen.Los edulcorantes naturales se pueden dividir en sacáridos y no sacáridosSegún su estructurunquímicuny propiedades. Estudios recientes hanseñalado que los edulcorantes sintéticos pueden conducir al desequilibrio de lunflora intestinal y la intolerancia ala glucosa, causando trastornos metabólicos [1], y se han convertido en un nuevo tipo de contaminante que causa la contaminación ambiental [2]; Mientrasque la alta ingesta de azúcar contribuye a la aparición de caries dentales, obesidad, diabetes, síndrome metabólico y enfermedades cardiovasculares [3-5]. Sustancias naturales no azucaradas de origen vegetal han atraído cada vez más la atención como una nueva generación de edulcorantes que pueden satisfacer los antojos de dulces debido a su aladulzor [6], bajas calorías [7], seguridad [8]y falta de cariogeni[9].

En la actualidad, los principales edulcorantes naturales no azucarados que han sido desarrollados y utilizados en el país y en el extranjero son: taumatina, glicósidos de estevol, mogrosidos y ácido glicirrizico [6](tabla 1), entre los cuales el más dulce es la taumatina, pero presenta un sabor amargo y el "mal sabor" del regaliz, y tiene las desventajas de dulzor retardado y una duración excesivamente larga [17]; El segundo es el edulcorde de frutas monje, que no tiene regusadesagradable y es el único edulcortotalmente naturalque puede reducir la grasa [14].Mogroside V(M5) es la fuente principal de la dulzura de Mogroside [18]. ununa concentración de 1/10.000, su valor de dulzor es 425 veces el de la sacarosa al 5% [19]. También tiene muchasactividades farmacológicas, como el alivio de la tos y la flegm [20], contra el cáncer [21-22], anti-oxid[23], y muchas otras actividades farmacológicas, por lo que es una nueva generación de edulcorantes funcionales que se están desarrollando en todo el mundo. Debido a las muchas dificultades involucradas en el cultivo de Luo HanGuo[25], y el hecho de que el contenido de M5 en el fruaentero es sólo 0,8% — 1,3% (p/p) [26], es difícil purificar el complejo producade sus análogos, y es imposible lograr una producción a gran escala confiando en la extracción de Luo HanGuo.

El desarrollo del cultivo de células vegetales [27], la ingeniería metabólica [28]y la biología sintética [29]han proporcionado ideas de producción sostenible para la adquisición de productos vegetales naturales. El cultivo de células vegetales es difícil de usar para producir productos naturales especializados debido a su alto costo, larga escala de tiempo y bajo rendimiento. Además, la complejidad de las células vegetales y la falta de herramientas genéticas y métodos adecuados hacen que la ingeniería metabólica de las células vegetales sea un reto para la producción de productos naturales complejos M5, que requieren vías de biosíntesesde múltiples pasos [30]. Por lo tanto, el cultivo de células vegetales y la ingeniería metabólica pueden no ser un método viable para la producción a gran escala de M5. La biología sintética es una ciencia que ha surgido en los últimos años para rediseñar, diseñar, construir y aplicar sistemas de vida y procesos [31].

En comparación cellos métodos tradicionales, tiene las ventajas de ciclo corto, alto rendimiento, seguridad y no contaminación, y un proceso de extracción simple. Es un nuevo modelo de producción verde y eficiente. Celel continuo desarrollo de la investigación en biología sintética y una profunda comprensión del mecanismo de biosíntesesmolecular de los mogrosidos en Luo HanGuo[32], el uso de microorganismos para sintetizar M5 se ha convertido en una nueva forma de producción a gran escala, que es de gran importancia y amplias perspectivas en la satisfacción de la demanda de los consumidores de edulcorantes naturales. Este artículo se centra en una revisión del mecanismo de biosíntesis y el progreso de la investigación en biología sintética de M5, y discute los desafíos que enfrenta la síntesis microbiana, con el fende proporcionar una referencia para la investigación en biosíntesis de M5.

1estructura y actividad farmacológica del Mogroside V

SiraitiaGrosvenorii.es una especie de planta perteneciente a la familia Cucurbitaceae. Se utiliza como una medicina tradicional China común en China [33]por sus efectos de humedecer los pulmones para aliviar la tos, enfrila sangre y humelos intestinos para promover los movimientos intest. Su principal ingrediente activo es el glucósido dulce [34]. Los investigadores [19,35-36] han aislado e identificado una variedad de glucósidos dulces en Siraitiagrosvenorii, cuya estructura básica se muestra en la figura 1. El número de unidades de glucosa y la forma en que están conectadas producen moléculas edulcorantes con sabores significativamente diferentes: el disacáridoEl edulcoriie tiene un sabor extremadamente amargo, mientras que el pentasacárido M5 tiene un sabor extremadamente dulce [37].

M5 es el componente del edulcorde Luo Han GuoCon la mayor dulzura y contenido [38]. Fue aislado por primera vez por académicos japoneses como Takemoto Tsunematsu [39-41], y la estructura de la aglicone fue identificada como el tetracíclictriterpenmomordinol por métodos espectroscópicos, construyendo así la estructura completa de M5. La fórmula molecular de M5 es C60H102O29, que se forma mediante la adición de unidades de glucosa al momordinol en las posiciones C3 y C24. R2 es dos unidades de piranosa Unidas por un enlace − -1,6-glicosídico, R1 es un grupo ramirami3-glucopyranosil unido por enlaces − -1,6-glicosídicos y enlaces − -1,2-glicosídicos.

Edulcorantes naturales no azucarados de plantasEl origen a menudo exhimúltiples actividades farmacológicas (tabla 1). M5 tiene muchas funciones, incluyendo el alivio de la tos y la flema, anti-cáncer, anti-oxid, y la regulación de azúcar en la sangre. Estudios han demostrado que el ingrediente activo en Luohanguo que alivia la tos es 50% extracto de alcohol por volumen, y el M5 aislado puede reducir significativamente el número de tos en ratones, prolongar el período de latencia de la tos, y aumentar significativamente la excreción de fenol rojo en la tráquea, lo que indica un cierto efecto expectorante [20]. El M5 puede inhibir la proliferación y supervivencia de las células cancerosas de páncreas al apuntar a múltiples dianas biológicas [21], lo que se confirmó en un modelo murino de xenoinjerde cáncer de páncreas. 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA), 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) y ácido peroxoxnitro(ONOO -) son carcinógenos que inducen la transformación de células normales en células tumorales. Se encontró que el M5 retarla la transformación de las células normales en células de cáncer de piel al antagonilos carcinógenos en una prueba de carcinogéen de piel de ratón [22], lo que indica que el M5 tiene el efecto de prevenir el cáncer de piel causado por carcinógenos químicos. El M5 y el 11-o-mogrosido Vpueden eliminar significativamente especies reactivas de oxígeno (O2 - ·, H2O2 y ·OH) e inhibiel daño oxidativo del ADN.Mientras que el 11-o-mogrosideV tiene un mayor efecto de búsqueda en O2 - · y H2O2 que M5, pero M5 tiene un mejor efecto de búsqueda en ·OH [23]. Se encontró que M5 puede inducir la secreción de insulina en la célula de insulinoma RIN-5F,revelando así el efecto regulador de la glucosa sanguínea de M5 en el nivel celular para pacientes diabéticos. Este estudio sugiere que el extracto de Luo Han Guo, especialmente M5, tiene el potencial para prevenir y tratar la diabetes tipo 2 [24].

2. Investigación sobre el mecanismo de biosíntesis de Mogroside V

La biología sintética es la reconstrucción de las vías de biosíntesis existentes en las células microbi[29] para obtener fábricas de células microbique producen los productos deseados, logrando así la producción a gran escala de los compuestos objetivo. Por consiguiente, la clariMecanismo molecular de la síntesis de M5 en Luo Han GuoSentará las bases para el uso de la biología sintética para construir fábricas de células y lograr la síntesis envitro.

2.1 patrón de acumulación de mogrosidos

Comprender el patrón de acumulación deMogroside es propicio para un mejor análisis del mecanismo molecular de M5Síntesis. La investigación sobre el patrón de acumulación de mogrosidos durante el desarrollo de Luohanguo ha demostrado que el contenido neto de mogrosidos se conserva, es decir, el contenido total de mogrosidos se mantiene sencambios durante todo el proceso de crecimiento [42]. Durante las primeras etapas del desarrollo del fruto, los glucósiestán principalmente en forma de mogrosidos IIE, con R1 y R2 siendo ambos grupos monosacáridos. Esto indica que el primer paso en la glicosilación de los glucósidos son dos glicosilaciones primarias, después de lo cual el segundo grupo glicosil está vinculado a R1 por un enlace -1,6-glicosídico, lo que resulta en la acumulación de mogrósido IIIX. En una etapa posterior (77 d después de la flor), un gran número de productos tetrasacáridos aparecieron, principalmente sialenosidos (siamenosidos), cuyo R1 contiene una rama formada por un enlace -1,6-glicosídico y un enlace -1,2-glicosídico. El consumo de productos de tetrasacárido comenzó 77 días después de la floración, y la acumulación de R2 M5, que contiene dos fracciones de azúcar, aumentó considerablemente durante la etapa final de maduración. El principal componente del glucósido dulce en los frutos maduros 103 d después de la flores M5. El patrón de acumulación de mogrosidesugiere que la vía biosintética de M5 es que mogroside primero se somete a glicosilación primaria en las posiciones C3 y C24,y luego glicosilación ramise lleva a cabo sobre esta base [32].

2.2 Mogroside V biosíntesispathway análisis(en inglés)

El análisis de transcriptoma y metabolomé es una estrategia eficaz para dilucidar las vías de biosíntesis de productos naturales de plantas [43]. En 2016,los investigadores israelíes ItkenetAl.[32]lograron un análisis completo de la vía de biosíntesis M5 basado en el transcriptoma yDatos del genoma de Luo Han GuoLa vía de biosíntesis M5 puede ser dividida en tres etapas: la etapa de síntesis de precursores aguas arriba, la etapa de formación del esqueleto de la corriente media, y la producción del núcleo padre aguas abajo y la etapa de modificación.

2.2.1 síntesis de precursores IPP y DMAPP

Los precursores aguas arriba para la síntesis de terpenincluyen pirofosfato de isopentenilo (IPP) y pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP). Hay dos vías diferentes para la biosíntesis de IPP y DMAPP en plantas: la vía del ácido mevalónico (vía MVA) y la vía del mehyl-eritritol fosfato (vía MEP). La elección de diferentes vías depende del tipo de producto sintético y de la localización espacial subcelular [45]. La vía MEP se utiliza principalmente para la síntesis de monoterpenos, diterpenos y tetraterpenen en plastidos [46], mientras que la vía MVunse utiliza principalmente para la síntesis de sesquiterpenos, triterpenos y politerpenen en el citoplasma [47]. Senembargo, las dos no son completamente independientes, y la IPP intermedia común puede ser utilizada una por la otra a través de la membrana plasmática [48].

M5 es un producto de saponde triterpenen en el citoplasmaSus precursores IPP y DMAPP se generan unpartir de la acetila coenzima unA través de la vía MVA.Primero, dos moléculas de la acetilcoenzima A se forman A partir de la acetilcoenzima A tioesterasa (ATOT) y la 3-hidroxi3-metilglutaril coenzima A sintasa (HMGS) para formar la 3-hidroxi3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA). Entonces, bajo la catálisis de la 3-hidroxi3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGR), 3-hidroxi3-metilglutaril-coa (MVA) se forma, que luego se convierte en IPP por las enzimas metil-d-eritritol-4-fosfato quinasa (MK), metil-d-eritritol-3-fosfato quinasa (PMK) y metil-d-eritritol-3-fosfato descarboxilasa (MVD). La IPP se convierte en su isómero de doble Unión, dimetilalilo pirofosfato (DMAPP), por la enzima isopentenil pirofosfato isomerasa (IPI).

2.2.2 formación de los esqueletos 24,25-epoxigulldienol

La pirofosfato sintasa de geranilo (PS) cataliza la formación de pirofosfato de geranilo (GPP) a partir de IPP y DMAPP. A continuación, cataliza la síntesis de pirofosfato de farnesil (FPP) a partir de una molécula de IPP. FPP se convierte en escualeno(SQ) por escualenosintasa(SQS). SQS es una enzima bifuncional que primero cataliza la condensación de dos moléculas de FPP para formar difosfato pre-squaleno (PSPP), y luego convierte PSPP a SQ en presencia de NADPH y Mg2+[44].

Durante mucho tiempo, los científicos creían que la squalene epoxidasa(SQE) catalizó la reacción de un solo paso de SQ para formar el 2,3-epoxisqualeno lineal, que luego se cicpor la ciclaspara formar la sustancia del esqueleto, ulipristal[49]. Senembargo, estudios recientes han demostrado que el precursorde la aglicona es 24,25-epoxilup-20 (29)-en-3-ol, no cucurbitadienol, y que el precursores 2,3; 22,23-diepoxisqualeno, no 2,3-epoxisqualeno. SQ sufre dos reacciones de epoxidación consecutivas catalizadas por SQE, en orden, produciendo 2,3-epoxisqualeno, 2,3; 22,23-dioxosqualeno, y este último siendo cica 24,25-epoxigulustrenol bajo la catálisis de la cucurbitadienolsintasa (CDS) [32].

2.2.3 producción y modificación del núcleo original, mogrosido

La característica única del triterpenoide tetracícliccucurbitanoMogroside es la oxigenespecífica de la regiónEn las posiciones C3, C11, C24 y C25 (figura 2), formando el mogroside del núcleo parental [32]. Por lo tanto, el principal reto en la identificación de la etapa de síntesis del núcleo madre es su única hidroxilación, especialmente la trans-hidroxilde las posiciones C24 y C25. ItkenetAl.[32] encontraron que la epóxido hidrolasa (EPH) es responsable de catalizar la hidroxilde las posiciones C24 y C25 de 24,25-epoxilup-20 (29)-en-3-one para generar trans-24, 25-dihidroxilup-20 (29) -en-3-ona, que luego es hidroxilen la posición C11 por un miembro de la familia CYP87, CYP87D18(CYP102801),[50]en el sistema de la enzima citocromo P450 (CYP450) para generar lupeol. El orden de las reacciones de hidroxilación también se ha propuesto: la proteína ef tiende a unirse a epoxilup-20 (29)-en-1-ol en lugar de la lineal 2,3; 22,23-diepoxisqualeno, por lo que la reacción ef sigue la reacción de ciclación CDS; El grupo hidroxilo hidrofílico adicional en C11 prevendría el acoplamiento en la bolsa hidrofóbica de la ef, por lo que la reacción de hidroxilde C11 ocurre después de la reacción ef.

El paso final en elLa síntesis de M5 es la modificación de la glicosilaciónDelas posiciones C3 y C24 de mogroside. Se encontró que la glicosilación en la posición C24 aumenta la afinidad por la glicosilación en la posición C3 acoplando el sustrcon la glicosiltransferasa. El orden de la glicosilación se determinó basánDosis dosisen el patrón de acumulación de los mogrosidos: mogrosidos primero sufre glicosilación primaria en la posición C24 por glicosiltransferasa UGT720-269-1 para generar mogrosidos − -A1; Este último es entonces glicosilado en la posición C3 por UGT720-269-1 para generar mogroside ⅡE; Posteriormente, UGT94-289-3 es responsable de la glicosilación ramide de la cadena de la glucosa en las posiciones C3 y C24, y el intermediario tetrasacárido se sintepara formar M5[32].

3 Mogroside V Synthetic Biology preliminary Research (en inglés)

Como edulcornaturalsenazúcar, la producción microbiana del edulcorde de proteína taro tiene una larga historia de investigaciónSe ha logrado en una variedad de microorganismos [51-53], pero el rendimiento es bajo. La vía biosintética de la stevioside fue completamente elucidada en 2013 [54]. En la actualidad, se ha informado de la fermentación y síntesis de productos de steviosida, principalmente incluyendo rebaudioside A,rebaudioside D y rebaudioside M [55-56], pero el rendimiento es bajo, porque la ruta sintética construida es relativamente larga.

En 2016, XuetAl.[57]informaron udp-glucurronic Ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácidotransferasa GuUGAT (perteneciente a la familia UGT73) de orozuz, que cataliza la glucosilación del ácido glucurónico de dos pasos del ácido glicirrizico para formar ácido glicirrizico, revelando así la vía completa de la biosíntesis del ácido glicirrizico. Profesor LiChun's Research Group [58]utilizó una bacteria diseñada que produce ácido glicirrizico como base e introdujo el gen humano UGT1A3 de la glicosiltransferasa humana, el gen UGDH (Hs) de la udp-glucosa deshidrogenasa humana, y el gen UGDH (Ec) derivado de Escherichiacoli para obtener una bacteria recombinque produce ácido glicirrizico. Debido a la elucitardía de laBioSintéticas sintéticas sintéticaspathway deMogroside yelLong pathway (en inglés)La investigación sobre la biología sintética del M5 es limitada.

3.1 selección y optimización de células de chasis

Las células de chasis son fábricas para la síntesis de productos naturales. La selección de células de chasis con sistemas operativos maduros y estabilidad genética es la base para la producción eficiente de productos naturales. Los microorganismos modelo Escherichia coli y Saccharomycescerevisiaese utilizan a menudo como células de chasis. Saccharomycescerevisiae tiene ventajas únicas en la investigación de la síntesis heteróloga de productos naturales complejos como el M5: la vía endógena del MVA y la vía de la síntesis del ergosterol pueden proporcionar estables precursores IPP, DMAPP y 2,3-epoxy-squaleno [59-60], y el sistema completo de membrana y la modificación post-traduccional son conducentes a la expresión activa de la ciclasy CYP450. El 2,3-epoxisqualeno es un precursor común para la síntesis de los esquede triterpenoides y esteroles en las plantas [61]. Senembargo, en la biosíntesis de edulcorantes, el precursor de la síntesis del esqueleto es el 2,3; 22,23-diepoxisqualeno. La epoxidasa de escualeno endógena (ERG1) en Saccharomycescerevisiae puede oxidar 2,3-epoxisqualeno a 2,3; 22,23-bisepoxisqualeno [32,62], lo que significa que el Saccharomyces cerevisiae ERG1 puede reemplazar a SgSQE.

La mayor parte del 2,3-epoxisqualeno en las células de Saccharomyces cerevisiae entra en la vía de síntesis de ergosterol a través de la lanosterol sintasa (ERG7) [63], compipor el flujo metabólico a la conversión mogroside. La cepa GIL77 de Saccharomyces cerevisiae acumula altas concentraciones de 2,3-epoxisqualeno debido a la falta de ERG7 [64]y se utiliza a menudo como una célula de chasis para verificar la función de las enzimas relacionadas con la síntesis de mogrosidos. Con el desarrollo continuo de la investigación biológica sobre la síntesis de saponde triterpen, las estrategias para optimizar Saccharomyces cerevisiae para acumular grandes cantidades de 2,3-epoxisqualeno se han mejorado gradualmente. 1) sobreexpresión de genesrelacionados con la síntesis de terpenos en la vía MVA [65-66]; 2) la inhibición de la ergosterol sintasa usando el inhibidor R0 48-8072 o el sistema CRISPR/dCas9 para inhibir la expresión de ERG7 [32,63], abajo regular la rama de la síntesis de ergosterol; 3) utilizar el gen mutante upc2-1 del factor de transcripción global UPC2 para aumentar directa o indirectamente la eficiencia de transcripción de genesrelacionados con la vía MVA [67].

3.2 clonación y expresión de genes de enzimas clave

Para lograr la síntesis de novode M5 en células microbianas, los genes de enzimas clave necesitan ser heterólogos ensamblados. Por lo tanto, la clonación de genes enzimproporcionará las partes para el ensambheter, y la expresión heteróloga de enzimas sentará las bases para la investigación funcionAl.Las enzimas clave que han sido clonadas y expresadas hasta ahora son SQE, CDS,EPH,CYP450 y glicosiltransferasa.

3.2.1 Squalene epoxidase

La epoxidasa de squaleno realiza la doble epoxidación del squaleno, que se ha reportado en muchos sistemas triterpenoidesintasa [68-70], y la epoxidasa de squaleno de planta expresada funcionpuede producir simultáneamente squaleno mono- y di-oxidado [62,71]. En 2018, ZhaoHuan etAl.[72]clonaron dos fragmentos largos anotados como genes SQE de Luo Han Guo, ambos conteniendo un marco de lectura abierto completo de 1.575 BP que codifica 524 aminoácidos, y los nombraron SgSQE1 y SgSQE2, respectivamente. Dado que los N-termini de las secuencias de proteínas codificadas por SgSQEs ambos tienen dominios transmembrana, existen como inclusiones inactivas cuando se expresan en procariotas, y la actividad enzimno puede ser verificada. El acoplmolecular del sustrproteindica que los SgSQEs pueden interactuar con el ligando 2,3-epoxisqualeno para formar enlaces de hidrógeno, y se especula que pueden tener la función de generar bis-epoxisqualeno. Más tarde, ItkenetAl.[32] modelaron la proteína SgSQE y mostraron que la presencia del primer epóxido no impidió el acoplde de la segunda epoxidación, lo que indica que SgSQE puede sufrir una reacción de doble epoxidación.

3.2.2 Cucurbitadienol sintasa

El 2,3-epoxisqualeno está formado por protonación, ciclización, rearreglo y deprotonbajo la catálisis de diferentes tipos de oxidosqualeno ciclas(OSC), que forma el esqueleto de fitoesteroles y triterpen[73]. Por lo tanto, hay competencia entre diferentes tipos de OSC. Como miembro de la familia OSC,CDS es una ciclasclave en la síntesis de mogrósidos. Su expresión y actividad afectan el flujo metabólico de la conversión de 2,3-epoxisqualeno a mogrosido, lo que determina el rendimiento de los mogrosidos.

DaietAl.[74]identificaron SgCDS mediante la secuencide ARN (arn-seq) y el análisis Digital digitalde perfil de expresión génica (DGE) de Luo Han Guo. El cDNA es de 2.800 BP de longitud y contiene un ORF de 2.280 BP, que codifica una proteína con 759 aminoácidos con un peso molecular predicho de 84,4 kDa. La función de ciclización de SgCDS fue posteriormente verificada utilizando la cepa de levadura GIL77, que puede ciclizar 2,3-epoxisqualeno a cucurbitadienol. De hecho, ItkenetAl.[32] usaron Saccharomyces cerevisiae y transformel tabaco Nicotiana tabacum L para analizar funcionlas SgCDS y encontraron que las SgCDS no sólo pueden ciclizar 2,3; 22,23-bisepoxisqualeno, sino también cic2,3-epoxisqualeno para producir squaleno, aunque este último no está involucrado en la síntesis de Mogroside. Otros estudios han demostrado que para el 2,3-epoxisqualeno, la ciclización de SgCDS precede a la epoxidación de ERG1, haciendo SgCDS principalmente exhila función de cicde 2,3-epoxisqualeno.

3.2.3 CYP450 y glicosiltransferasa

CYP450 es una superfamilia de genes en plantas que juegan un papel clave en la oxidde productos naturales como terpenos, flavonoides, alcaloides y lignina [75]. Con especificidad de sustrestricta y baja similitud de secuencias. Glicosiltransferasas pueden ser miembros de la segunda planta más grande de la familia de enzimas 1UGTs, que la transferencia de diferentes azúcares o azúcares a diferentes receptores, y requieren diferentes glicosiltransferasas [76]. Por lo tanto, es relativamente difícil de descubrir y clonar eficientemente los genes CYP450 y glicosiltransferasa que catalizan la biosíntesis de metaboliespecíficos. TangetAl.[77]identificaron y examinaron siete CYP450s y cinco UDPGs como genes candidatos responsables de la síntesis de M5 con base en la aplicación combinada de rna-sigsy DGE,combinada con la rápida acumulación de M5 después de 50-70 d después de la floración. Este método ha creado una manera efectiva de identificar genes candidatos responsables de la biosíntesis de nuevos metabolisecundarios en plantas no modelo.

Zhang ZhangZhangZhangZhangZhangetAl.[50] identificaron una enzima multifuncional citocromo P450 (CYP87D18) y aGlicosiltransferasa (UGT74AC1) en Luo Han Guo. Ensayos de actividad enzimenvitro mostraron que CYP87D18 es responsable de catalizar la oxidde la posición C11 del furostanol para formar 11-oxofurostanol y 11-hidroxifurostanol; UGT74AC1 puede transferir específicamente glucosa a la posición C3 del loganinol para formar loganenIE. Casi al mismo tiempo, ItkenetAl.[32] identific191 CYPs y 131 UGTs en Momordica grosvenori, y preliminarmente examinaron 40 CYPs y 100 UGTs que se expresaron en los frutos en desarrollo. Se realizó verificación funcional en levadura y Escherichia coli, respectivamente. Los resultados mostraron que CYP87D18 (CYP102801) cataliza la hidroxilación de la posición C11 de trans-24,25-dihidroxicolest-4-en-3-one para producir ácido rosmólico; UGT74-345-2, UGT75-281-2, UGT720-269-1 y UGT720-269-4 son responsables de la glicosilación primaria en la posición C3, entre los cuales UGT720-269-1 es también la única enzima responsable de la glicosilación primaria en la posición C24. UGT720-269-1, UGT94-289-1, UGT94-289-2 y UGT94-289-3 son responsables de la glicosilación ramide las cadenas de glucosa C3 y C24.

3.3 biosíntesis de cucurbitadienol

LiShou-lian etAl.[78]usaron un compuesto triterpenoide obtenido en el laboratorio para expresar y fermentar heterólogamente los SGCD clonados en la cepa de chasis de levadura WD-2091 (las vías FPS,SQS,SQE y MVA fueron sobreexpresadas y reguladas), los SGCD clonados fueron expresados y fermentheter, y el rendimiento de cucurbitadienol fue de 27,44 mg/L. El gen CDS fue transferido del plásmido de alta copia pRS425 al plásmido de baja copia pRS313 para regular la expresión del gen CDS, y se obtuvo la fábrica celular 313-SL-CB Saccharomyces cerevisiae, con un aumento del 202.07% en la producción de cucurbitadienol. El rendimiento de fermentación de alta densidad alcanzó 1.724,10mg/L,que es actualmente el rendimiento más alto de síntesis microbiana de cucurbitadienol. Esta investigación ha sentado las bases para la creación de una fábrica celular eficiente para la producción de triterpenoides tetrtetrde tipo cucurbit.

La construcción de una fábrica celular microbiana para M5 puede implicar la transferencia de la vía de biosíntesis original o la reingeniería y la construcción de toda la vía metabólica. Aunque se ha demostrado que cucurbitadienol no es el esqueleto para la síntesis de loganina, la bacteria 313-SL-CB, que produce altos niveles de cucurbitadienol, se puede utilizar como una célula de chasis. El gen oxidpuede ser recombinado para convertir cucurbitadienol a 24,25-epoxicucurbitadienol, y luego catalizado por EPH,CYP450 y glicosiltransferasa para producir M5 (figura 3).

4 debate y perspectivas

Con la mejora de las personas#39;s concienciación sobre la salud, consumidores ' La búsqueda de alimentos ya no se limita a la satisfacción de sus papilas gustativas, sino que también prestan cada vez más atención a su salud y funcionalidad, lo que ha llevado a un aumento "explosivo" en la demanda de edulcorantes naturales no azucarados [30]. En particular,M5, uno de los world's edulcorantes naturales más fuertesNo sólo cumple con el público#39;s demanda como un edulcornaturalsin azúcar, pero también sirve como un sustituto de la sacarosa para diabéticos y personas obesas debido a sus propiedades medicinales [79]. La demanda de M5 está aumentando gradualmente en todo el mundo [80], y los métodos de extracción de plantas ya no pueden satisfacer la demanda del mercado. La biología sintética tiene ventajas únicas en la extracción eficiente y sostenible de productos vegetales naturales, y se ha aplicado a la síntesis de diversos productos naturales [81-83]. Por lo tanto, la producción a gran escala de M5 usando biología sintética es una tendencia inevitable. En la actualidad, la vía biosintética de M5 ha sido completamente dilucidada, y las enzimas clave han sido clonadas y funcionalmente verificadas, pero la investigación sobre la producción microbiana todavía es deficiente.

Basándonos en los principios de la biología sintética, proponemos dos estrategias para construir una fábrica celular M5: en primer lugar, como se mencionó anteriormente (figura 3), la transformación a M5 se puede lograr sobre la base de la bacteria de alto rendimiento que produce cucurbitadienol 313-SL-CB, que es la forma más conveniente; En segundo lugar, los cinco genes de enzimas que participan en la conversión de 2,3; 22,23-dioxsqualeno a M5 (Fig. 2) se pueden recombinar en células de levadura para lograr la síntesis de novo. Todavía hay muchas dificultades en la realización de la producción microbiana de moléculas activas M5 utilizando estas dos estrategias: en primer lugar, la enzima que cataliza la oxidde squaleno a 24,25-epoxisqualeno en la primera estrategia no se ha descubierto, y la segunda estrategia, la levadura#39;s endógeno ERG1, no puede proporcionar suficiente 2,3; 22,23-bisepoxisqualeno para SgCDS. En segundo lugar, la vía de biosíntesis M5 implica muchas enzimas e intermediarios, el proceso metabólico es complejo, y es difícil lograr la expresión eficiente y coordinada de genes exógenos integrados en una sola célula microbiana, lo que también causa una mayor presión metabólica sobre el huésped. Por último, SGCD,UGT720-269-1 y UGT94-289-3 son enzimas no específicas que pueden actuar sobre una variedad de sustrpara formar diferentes productos, y el orden y dirección de la catálisis en la célula del chasis son difíciles de controlar.

Para abordar los problemas, se proponen las siguientes estrategias: identificar y analizar las oxidasas que catalizan la producción de 24,25-epoxilupeol a partir de lupeol y SQEs que catalizan de manera eficiente la reacción de epoxidación; Regular más precisamente la vía aguas abajo de 2,3-epoxisqualene y 2,3-epoxisqualene es más dirigido hacia la síntesis de mogroside. En los últimos años, la ingeniería modularde co-cultivo se ha convertido en una nueva estrategia para reducir el estrés celular y aumentar la producción de productos objetivo [84-85]. Por lo tanto, la vía de biosíntesis de M5 puede ser razonablemente dividida en diferentes módulos, y cada módulo puede ser integrado en una cepa específica. Las cepas reclutadas se pueden integrar en un solo espacio, y luego co-cultivar las cepas reclutadas para lograr la síntesis de novo de M5. La biología estructural se utiliza para analizar la estructura de las proteínas de la enzima y entender el mecanismo catalítico específico, y la especificidad de sustrde la farnesiltransferasa y glicosiltransferasa se mejora a través de la modificación enzimadecuada. Se desarrollan tecnologías de monitorización en tiempo real y regulación metabólica dinámica para conseguir catálisis dirigida de enzimas. Con el desarrollo de la biología sintética y la ingeniería metabólica, elLa producción a gran escala de M5 seguramente se realizará.

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