¿Cómo se Produce la coenzima Q10 de ubiquinona por fermentación?

Coenzima Q10 (ubiquinona-10, coenzima Q10, COQ10), también conocida como ubiquinona (en adelante denominada COQ10). Su fórmula molecular es C59 H90 O4 y su peso molecular es 863. La fórmula estructural es como sigue:

Ubiquinona coenzima Q10 Es un compuesto de quinona soluble en grasa con cristales de color naranja amarillo a temperatura ambiente y un punto de fusión de 49 ℃, y es inodoro y sin sabor [1]. Las funciones fisiológicas de COQ10 se atribuyen principalmente a las propiedades redox de la quinona y las propiedades físicas de la cadena lateral isoprenoide. Los estudios han demostrado que la COQ10 en el estado reducido y los monómeros de isopreno con todas las estructuras trans tienen una mayor actividad y efectos farmacológicos que la COQ10 en el estado oxigeny los monómeros de isopreno con todas las estructuras cis.

El papel de la COQ10 fue identificado por primera vez por MOOre et al. en 1940, pero no atrajo mucha atención clínica, y en 1957, Crane et al. puricoq10 de miocardio bovino y midió su estructura química, confirmando que la COQ10 en realidad juega un papel importante como un transportador redox en la cadena de transporte respirde los mamíferos.

Ubiquinona coenzima Q10 Se sabe que es un transportador de electrones soluble en grasa entre NADH deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa y complejo BC en la cadena respir, y es un elemento generador de energía celular, por lo que es un antioxidante natural y activador del metabolismo celular, y es importante en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, y puede mejorar la inmunidad humana y tratar enfermedades del sistema inmune humano. Como un antioxidante natural, puede ser utilizado en el cuidado de la salud y la belleza [2]. En China, el uso de las cápsulas de COQ10 está aumentando año tras año, pero las materias primas dependen básicamente de las importaciones, lo que requiere la producción nacional de grandes cantidades de materias primas y preparados baratos de COQ10.

Método de producción 1 COQ10

La COQ10 se encuentra ampliamente en tejidos de plantas y animales, así como en organismos microbianos. Los organismos microbianos generalmente contienen altos niveles de COQ10, mientras que los tejidos de plantas y animales contienen bajos niveles, haciendo de los microorganismos una buena fuente de COQ10.

Ubiquinona coenzima Q10 Se puede preparar por tres métodos: extracción de tejido animal y vegetal, fermentación microbiana y síntesis química. En la actualidad, la extracción de tejido animal y vegetal se utiliza principalmente en China. Los países de ultramar en su mayoría utilizan la fermentación microbiana, especialmente en Japón, donde la producción industrial de COQ10 por fermentación microbiana se realizó ya en 1977.

El método de síntesis química se caracteriza por condiciones duras y muchos pasos; Además, la mayoría de los monómeros de isopreno de COQ10 son estructuras cis, que no son biológicamente activas, y el contenido de subproductos es alto, por lo que el costo de purificación es alto. El método de extracción de tejido animal y vegetal es principalmente a partir del residuo de corazón de cerdo después de la extracción del citocromo C. El contenido de COQ10 en tejidos animales es bajo, con un rendimiento de solo 75 mg por kg de corazón de cerdo fresco [3], y la producción a gran escala está restringida por la limitación de materias primas y fuentes.

En contraste, la producción de Ubiquinona coenzima Q10 La fermentación microbiana tiene varias ventajas básicas: (1) el producto de fermentación es natural, biológicamente activo y fácilmente absorbido por el cuerpo humano; (2) no hay limitación de materias primas, y la capacidad de producción puede ser aumentada con escale-up. Sin embargo, su contenido limitado, baja eficiencia y alto costo de producción limitan la industrialización hasta cierto punto. Si podemos elegir cepas adecuadas para la modificación genética, selección direccional de cepas con excelente rendimiento, con el fin de aumentar el contenido de COQ10 en la bacteria, el costo de producción se reducirá considerablemente.

2 avances en la fermentación microbiana para la producción de COQ10

2. 1 selección de cepas

A pesar del alto contenido de COQ10 en los organismos microbianos en la naturaleza, los productos de fermentación son una mezcla de varios congégenos COQ10, lo que resulta en un alto costo de purificación de COQ10. Por lo tanto, la selección de cepas para la fermentación de COQ10 es de primordial importancia. Los microorganismos utilizados en la fermentación de COQ10 se enumeran en la tabla 1.

Tabla 1 contenido de COQ10  En organismos microbianos [4]

De la tabla anterior, se puede ver que el contenido de COQ10 en los cuerpos de las bacterias fotosintetizadoras (en adelante denominado PSB) era generalmente alto. En términos de estatus taxon, PSB pertenece al phylum Bacteroidetes, que se divide en el subphylum Rhodobacteria y el subphylum Green Thiobacteria, y el primero se divide en las familias Rhodobacteriaceae y Rhodobacteriaceae; R. capsulatus y R. sphaeroides pertenecen a la familia Rhodobacteriaceae, que es una de las opciones ideales para las cepas productoras de CoQ10.

2. 2 modificación genética de cepas

La ubiquinona coenzima Q10 La capacidad de producción de cepas silvestres no es suficiente para satisfacer las necesidades de producción y pueden modificarse genéticamente utilizando técnicas convencionales de mutagenesis e ingeniería genética. 

2. 2. 1 Mejoramiento para la regulación metabólica de COQ10

En 1976, Rudney propuso en una conferencia internacional sobre COQ10 que la vía de síntesis microbiana de COQ10 se divide principalmente en las rutas de biosíntesis de la síntesis de anillos aromáticos y la cadena lateral de isoprenilo. De acuerdo con la ruta de biosíntesis del anillo aromático y la cadena del lado del isoprenilo combinada con el mecanismo de regulación metabólica de las bacterias, la ruta de selección para la cría de cepas de alto rendimiento de COQ10 en fermentación industrial se puede dividir en las siguientes:

(1) Selección y reproducción de cepas mutantes con deficiencia de nutrientes

OlsOn y Rudney [5] encontraron que tanto los carotenoides y COQ10 son anabolizpor poliisopreno como precursores, y que la reducción de la producción de carotenoides puede promover la biosíntesis de COQ10. Por lo tanto, la selección de una cepa verde mutante PSB podría aumentar el contenido de COQ10. YOshida et al. [6] mutagenized R. sphae- roides Ky-4113, y obtuvo una cepa verde mutante con un aumento de 10 a 20% en el contenido de COQ10 en comparación con la cepa silvestre.

(2) Selección y cría de cepas mutantes resistentes a antagonmetabólicos

La eliminación de los inhibidores en la síntesis de COQ10 o su anabolismo relacionado aumentó los niveles de COQ10. YOshida et al. [6] examinaron cepas mutantes para precursores, inhibiy sus análogos estructurales (etiltionina, L-metionina, metilnaftoquinona y daunorrubicina) contra la síntesis de COQ10 y obtuvieron cepas mutantes de Agrobacterium tume "aciens con concentraciones de 10 a 20% más altas que las cepas silvestres. La cepa mutante de aciens fue 10-20% más alta que la cepa salvaje.

Otras cepas mutantes combinatorias, como las cepas mutantes deficientes en nutrientes y las cepas mutantes dobles resistentes a análogos estructurales, se pueden seleccionar de acuerdo con varias rutas para aumentar en gran medida el rendimiento del producto objetivo.

2. 2. 2 construir cepas genéticamente modificadas

Utilizando tecnología de biología molecular para encontrar el gen de la enzima clave de la cepa de producción de COQ10, e introduciendo este gen en la cepa de producción por tecnología de ADN recombinante, con el fin de aumentar el número de copias del gen de la enzima clave y expresarlo de manera eficiente, mejorando así la capacidad de sintetizar la ubiquinona coenzima Q10, esta es la ruta básica para construir la cepa de fermentación COQ10 recombinante.

El paso limitante en la biosíntesis de COQ en diferentes organismos es la condensdel ácido hidroxibenzoico con poliisoprencatpor la enzima pirofosfotransferasa paraben poliisopren. Estudios sobre esta enzima han demostrado que tiene una especificidad de sustrrelativamente amplia [7]. Basándose en este principio, el gen ubiA fue clonado a partir de E. coli e introducido en PSB, y la expresión de este gen se mejoró para obtener una cepa de alto rendimiento de COQ10.

Por otro lado, ya que PSB no es un receptor maduro para la ingeniería genética, la búsqueda de una vía metabólica utilizando E. coli como el receptor se dio vuelta a. Las longitudes de las cadenas laterales de los componentes principales de COQ están controladas por genes (por ejemplo, E. coli ispB, enzima coq1, bacteria fotosintética dds1, etc.), que son diferentes en diferentes células de diferentes organismos debido a los diferentes genes que controlan las longitudes de las cadenas laterales. E. coli es fácil de cultivar a alta densidad y tiene un sistema bien establecido para la expresión de genes exógenos, pero el principal componente de COQ sintetizpor E. coli es COQ8.

Por lo tanto, es posible clonar el gen que controla la longitud de la cadena lateral de COQ10 (dds1) de PSB e introducirlo en las células de E. coli, y al mismo tiempo inactivar ispB, el gen de control de la cadena lateral de COQ8, con el fin de realizar la producción a gran escala de COQ10 en E. coli recombinante. Actualmente, ShOkuhin et al. mostraron que es factible sintetizar COQ10 en E. coli [8,9].

2. 3 optimización de las condiciones de fermentación

Además de la aplicación de la teoría del control metabólico para seleccionar y criar cepas mutantes de alto rendimiento o construir cepas recombinantes para mejorar el rendimiento de la fermentación, la optimización de las condiciones de fermentación de las bacterias productoras es también una forma importante y eficaz de mejorar el rendimiento de la fermentación.

2. 3. 1 optimización del medio de cultivo

En ubiquinona coenzima Q10 Se realizaron experimentos de optimización mediante la selección de diferentes fuentes de carbono, nitrógeno, factores de crecimiento y sales inorgánicas para determinar la composición del medio de cultivo. Se ha demostrado que los iones metálicos, especialmente Mg2+, Fe2+ y Mn2+, pueden promover la producción de COQ10 por fermentación de R. sphaeroides. La adición de 12. 2 mmOl/L MgSo4, 1. 8 mmOl/L FeSo4  ·7H2 o，0 . 9 mmOl/L MnSo4 -7H2 o aumentó el rendimiento de COQ10 de 2.0 mg/g en seco a 2.0 mg/g en seco.0 mg/g en seco a 8. 9 ~ 9. 6 mg/g en peso seco (Asahi Chemical Industry CO., Ltd., Ja- pan, 1981). Además, los precursores pueden aumentar significativamente el rendimiento del producto y, bajo ciertas condiciones, controlar el flujo de productos anabólicos en la bacteria. Los precursores reportados para ser añadien la producción de la fermentación de COQ10 son ácido p-hidroxibenzoico, ácido mevalónico, isopentenol y geraniol [10].

2. 3. 2 optimización de las condiciones de cultivo

(1) mezcla/aireación

El efecto de la agitación y la aireación sobre la producción de CoQ10 varía dependiendo de la cepa, con una promoviendo la producción de CoQ10 [11] y la otra inhibiéndola [4,12]. Según los estudios existentes, la agitación y aireación son desfavorables a la producción de CoQ10 por R. sphaeroides. Sakato et al. investigaron el efecto de la agitación y la aireación en la producción de CoQ10 usando la fermentación de R. sphaeroides Ky8598 para la producción de CoQ10 [13]. Los resultados mostraron que el mejor crecimiento bacteriano se logró cuando el potencial redox (ORps) fue - 150 mM, y la mayor producción de CoQ10 se logró cuando el ORps fue - 200 mM, es decir, la restricción del suministro de oxígeno fue favorable tanto para el crecimiento bacteriano como para la producción de CoQ10.

Sobre la base del estudio anterior, Yoshida et al. observaron el efecto del suministro de oxígeno en la microestructura de R. sphaeroides por microscoelectrónica [6]. Se demostró que la membrana interna del citoplasma de las bacterias cultivadas en condiciones de oxígeno limitado estaba bien desarrollada y tenía una estructura de múltiples capas, donde se encuentra el centro de fotoreacción de psB, lo que podría conducir a un mayor contenido de CoQ10 que el de las bacterias cultivadas en condiciones bien oxigen.

(2) luz solar

Rhodobacter sphaeroides es capaz tanto de la fotosíntesis bacteriana anaerobia especializada y la respiración aeróbica y la fermentación, y Car y ExCell han informado de que la producción de CoQ10 por psB es alta en condiciones anaerobias a la luz, pero disminuye drásticamente una vez que el cultivo se cambia a condiciones aeróbicoscuras [4].

(3) tiempo de incub.

Yoshida et al. encontraron que el contenido de CoQ10 era mayor cuando las bacterias estaban en el período de pre-estabilización [6]. Zhu Xufen et al. también encontraron que el contenido de CoQ10 en las bacterias aumentó con el aumento del tiempo de incub, y alcanzó el nivel más alto en la mitad del período de pre-estabilización, y luego comenzó a disminuir [14].

2. 4 CoQ10 extracción de células microbianas

Hay dos métodos para extraer CoQ10 de células microbianas: insaponificado y saponificado. La extracción insaponificable tiene la ventaja de que no destruye la CoQ10, aunque la cantidad de extracto obtenido es menor que la obtenida por saponificación [15]. La saponificación es el método clásico de extracción de sustancias liposolu, sencillo pero costoso y que está siendo eliminado en la producción industrial moderna [1,16]. El método de saponificación alcalrecientemente propuesto puede eliminar completamente el consumo de ácido gálico pirogálico y disolvente de etanol, y el uso de células triturácidas directamente saponificadas, por lo que el costo de producción de CoQ10 se reduce en gran medida, y por lo tanto es posible aplicar a la producción en masa industrializada.

3 perspectivas

Actualmente, el precio de los productos CoQ10 en el mercado es elevado. Especialmente en China, la mayoría de los productos de CoQ10 son importados, lo que se debe al bajo contenido de fermentación de las cepas y al bajo rendimiento de aislamiento y purificación. Por lo tanto, con el fin de realizar la producción industrial de CoQ10 por fermentación microbiana, es necesario utilizar métodos de mejoramiento microbiconvencionales y tecnología de ADN recombinante para modificar genéticamente las cepas de producción, aumentar el contenido de CoQ10 intracelular, y optimizar la ruta de extracción para reducir el costo de extracción y aislamiento.

Referencia:

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