¿De qué está hecho?

Con el aumento de lunprevalencia de la obesidad y la diabetes, "alimentación saludable y una vida baja en azúcar" se ha convertido en una tendencia popular en today's sociedad. En 2019, la Federación internacional de diabetes(IDF) publicó un informe que indica que el 9,3% de los adultos entre 20 y 79 años en todo el mundo tienen Diabetes, lo que significa que 463 millones de personas tienen Diabetes. Los gastos médicos para la diabetesrepresentan el 10% del gasto mundial en salud (aproximadamente 760 mil millones de dólares estadounidenses) [1~2]. En respuesta a los antojos diarios de dulces de estos pacientes y los obesos, existe una necesidad urgente de desarrollar edulcorantes que sean similares a la sacarosa en dulzor, pero que no provoque un aumento del azúcar en la sangre.

La Allulose puede satisfacer estas necesidades debido a su dulzor similar a la sacarosa, su contenido extremadamente bajo en calorías y sus especiales efectos fisiológicos. En los últimos años, la demanda en los mercados extranjeros ha ido en aumento. Las universidades nacionales, los institutos de investigación y las compañías de preparación de enzimas han desarrollado rápidamente investigaciones sobre la allulosa en los últimos años, y el número de artículos relacionados publicados ha aumentado año tras año [3].

1. Propiedades fisicoquímicas y funciones fisiológicas de la d-celulosa

La d-allulosa, también conocida como d-ribo-2-hexulosa, es un isómero diastereode d-fructosa en la posición C-3, y se puede preparar añadiendo diastereoisomerasa a d-fructosa. Fue originalmente aislado de psicofuranina y por lo tanto nombrado D-psicose[4]. En 2014, la conferencia internacional de azúcar raro celebrada en Japón oficialmente corricorricorrioficialmente el nombre convencional de D-psicose de D-psicose a D-allulose[5~6].

1. 1   Propiedades físicas y químicas de la d-celulosa

La d-allulosa es una rara hexosa típica. Es un polvo cristalblanco y un isómero de glucosa y fructosa. Su peso molecular es 180.16 y su fórmula molecular es C6H12O6. Es muy soluble en agua. untemperatura ambiente, 100g puede disol291g de allulose en agua [7]; El punto de fusión es 109℃, estable bajo temperatura y presión normales. Debido a su bajo punto de fusión, no es adecuado para el secado por pulverización para producir productos en polvo. La dulzura de la d-allulosa es 70% de la de la sacarosa [8], y su dulzura es suave. Comer la misma cantidad de allulose solo generará el 0.3% de las calorías de sacarosa [9].

1.2 funciones fisiológicas de la d-allulosa

1. 2. 1 efecto neuroprotector

Los científicos japoneses Takata etal. [10] encontraron que la d-allulosa de 50 mmol/L puede proteger los nervios al aumentar el nivel de glutatión intrace inhibir la apoptosesde las células PC12 de catecolamina inducida por la neurotoxina 6-hidroxidopamina. La adición de d-allululosa a la dieta diaria puede reducir eficazmente la incidencia de Parkinson's enfermedad.

1. 2. 2    Reducir el azúcar en la sangre

Estudios pertinentes han demostrado que después de oralIngestión de d-allulosaLa actividad de la glucoglucosidasa yla − -amilasa en el intestino puede ser eficazmente inhibida por la D-allulose[11], lo que reduce significativamente el nivel de azúcar en la sangre después de una comida. En un pequeño ensayo clínico, sujetos sanos que consumieron 75 g de maltodextrina y una dosis de d-allulosade 5 g o más presentaron concentraciones plasmáticas de glucosa e insulina más bajas [12].

1. 2. 3. Efectos hipolipemiantes y reducde peso

Ochiai et al. [13]mostraron que la alimentación con d-allulosa aumentó significativamente la actividad de la lipasa en ratas. Matsuo et al. [14] confirmaron experimentalmente que después de que las ratas fueron alimentadas con d-allulosa durante 28 días, la actividad de la enzima lipogéde su hígado se redujo significativamente, y el tejido adiposo abdominal fue significativamente menor que el de las ratas alimentadas con d-fructosa [8]. Estudios han confirmado que la d-allulosa puede promover la transcripción inversa del colesterol y reducir el colesterol de alta densidad, lo cual tiene el efecto de prevenir la aterosclerosis [15]. Además, numerosos estudios han demostrado que la d-allulosa tiene una fuerte capacidad para recoger especies reactivas de oxígeno (ROS) [16].

2 preparación de d-celulosa

La d-allulosa rara vez se encuentra en la naturaleza, sólo en pequeñas cantidades en higos, melaza de caña de azúcar, trigo y plantas de espino de rata, por lo que no es adecuada para la extracción de plantas. En la actualidad, los principales métodos para preparar la d-allulosa son la síntesis química y la conversión biológica de enzimas.

2. 1 método de síntesis química

Un método de síntesis química relativamente típico para la d-allulosa es utilizar glucosa como materia prima, molibdato como catalizador, y sintetizar A 80~120℃. Aunque la tasa máxima de conversión de este método puede alcanzar más del 40%, el contenido de cenizas del producto es demasiado alto para satisfacer las necesidades alimentarias. Además, la conducconductividad de la solución de reacción es tan alta como 10,000-20,000 μs/cm [17], lo que requiere electrodiálisis y purificación y desalinicon múltiples resinas de anión e intercambio catiónico, lo que resulta en un aumento de la carga de tratamiento de aguas residuales. Fang Zhijie et al. [18] desarrollaron un método para la síntesis química de allose a partir de glicerolida. El uso de disolventes químicos como tolueno y acetonitrilo en el proceso no sólo es perjudicial para el cuerpo humano, sino también engorroso. Otros métodos como la hidrogenación catalítica y el reordenamiento de Ferrier [19] también tienen problemas como la baja eficiencia de conversión y la grave contaminación ambiental, y no son adecuados para la producción industrial a gran escala.

2. 2 método de conversión enzimbiológica

La investigación sobre la biocatálisis de la celulosa comenzó relativamente pronto en el extranjero. Ken Izumori del centro de investigación de azúcar raro de la universidad de Kagawa en Japón propuso un conjunto de estrategias de conversión de azúcar raro basadas en años de investigación en bioconversión de azúcar raro, que se conoce como el método de "Izumoring" [20]. De acuerdo con la estrategia de conversión de azúcar de Izumoring Rare, actualmente hay dos métodos principales de bioconversión que pueden lograr la producción de d-allulosa. Uno es el uso de oxidorreductasas para generar d-alo-ceto-azúcares a partir de alo-initol (alolina), taro-initol y D-galacto-initol. Debido al alto costo de los sustratos en este método, no es comercialmente viable desde una perspectiva de costo [21-22]. Otro método es la isomeride de d-fructosa a d-allulosa por una isomerasa. En 1993, Izumori et al. [23] descubrieron una enzima de Pseudomonascichorii ST-24 que puede catalizar la isomeride C3 de la hexosa. Dado que su sustróptimo es la tagatosa, fue nombrada D-tagatose 3-epimerasa (enzima DTE, en lo sucesivo denominada DTE).

En 2006, Kimh et al. [24] de Corea del sur aislaron D-allulose 3-epimerasa (D-Psicose 3-epimerasa, DPE enzima, en lo sucesivo denominado DPE) de Agrobacterium tumefaciens, y su sustróptimo es D-allulose. El DPE exhibe una mayor actividad de isomeride de d-fructosa que el DTE[8]. En comparación con la investigación extranjera, la investigación nacional sobre la d-allulosa comenzó relativamente tarde. No fue hasta 2008 que Jiang Bo' equipo s en la universidad de Jiangnan [25] seleccionun DTE de Rhodobacter sphaeroides llamado SK011 de 30 muestras de barro y agua. Después del cultivo del frasco agit, se llevó a cabo la transformación celular completa, y el rendimiento fue de solo 6.54%. Desde 2010, la investigación sobre DPE/DTE se ha desarrollado rápidamente en China, con cinco master's y tesis doctorpublicadas en 2021 solamente [26-30].

Entre ellos, Wu Jing's equipo en la universidad de Jiangnan ha optimicontinuamente la modificación molecular y las condiciones de cultivo de fermentación del gen DPE derivado de Clostridium cellulolyticum H10, y aumentó la actividad de la enzima de fermentación de un tanque de 3L a 4567μ/mL[26]. En la actualidad, hay más de 400 genes de enzimas DPE anotados en el centro nacional de información biotecnológica de los Estados Unidos, y más de 20 han sido claramente reportados en la literatura. La enzima recombintiene una tasa de conversión de fructosa de alrededor del 30%. La adición de borato puede aumentar la tasa de conversión, y el borato en el complejo de borato de allulosa puede ser fácilmente eliminado usando resina de amberita IRA-743 y Dowex 50 [31].

3. Dirección de desarrollo de enzimas adecuadas para la industria de la celulosa

Aunque ha habido avances significativos en la d-allulosa en los últimos años, la mayoría de ellos se han centrado en la extracción de genes y la construcción de cepas, y ha habido relativamente pocos informes sobre el aislamiento y la purificación del producto [32]. Todavía hay algunas deficiencias en la investigación y desarrollo del producto y su efectiva combinación con la industrialización. Dado que la d-allulosa se utiliza principalmente en alimentos, a continuación se describe la dirección de las necesidades de industrialización en combinación con los requisitos de las leyes y reglamentos alimentarios y los problemas encontrados en el proceso de industrialización.

3.1 selección de cepas de expresión de bacterias recombinantes

Debido a las limitaciones de las enzimas naturales, tales como inestabilidad, espectro de sustrestrecho y baja eficiencia catalítica, no son adecuados para la aplicación directa en la producción. Es necesario modificar el gen que codifica la proteína diana a nivel molecular, y luego detectar mutantes con propiedades significativamente mejoradas [26]. Teniendo en cuenta la inocuidad de los alimentos y el cumplimiento, así como la industrialización en consideración, la elección de las bacterias recombinantes debe basarse en microorganismos de grado alimentario, no patógenos, no fácilmente infectados por fagos, y con la capacidad de secretar proteínas de manera eficiente. Bacillus subtilis es una bacteria aerógrampositiva que puede formar esporas y tiene una pared celular que no contiene endotoxinas. Es la especie más antigua del género Bacillus en ser usada como hospede de ingeniería genética. Como un microorganismo reconocido como seguro por la FDA, Bacillus subtilis se ha utilizado durante mucho tiempo en la preparación de alimentos fermentados. Bacibacisubtilis recombinante tiene las ventajas de un cultivo simple y rápido, una buena base de fermentación y tecnología de producción, y es un huésped de expresión ideal para enzimas industriales [33].

3. 2 la dirección de modificación de la enzima DPE

Aunque la dirección de investigación en los últimos años ha tenido en cuenta la posibilidad de industrialización hasta cierto punto, se centra principalmente en mejorar la estabilidad térmica de la enzima DPE. A continuación se describen los requisitos para las enzimas industriales desde una perspectiva de industrialización.

3.2.1 pH óptimo de la enzima

El pH óptimo para las enzimas es preferiblemente la acidez débil, y cuanto más amplio sea el rango, más propicio para la industrialización. De acuerdo con la rara estrategia de conversión de azúcar, la producción enzimde un solo paso de D-allulose utiliza relativamente barato fructosa como sustry es catalizada por la enzima DPE para producir allulose. Senembargo, la producción de alulosa a partir de fructosa por DPE es una reacción reversible, y el tratamiento enzimse requiere después de que la reacción se completa. Los sustrfructosa y allulose son más propensos a sufrir la reacción de Maillard en condiciones de alta temperatura, alcalinidad y la presencia de proteínas, lo que aumenta el costo de decoloración con carbón activado para la posterior refindel azúcar. La elección industrial del valor de pH más adecuado es DPE débilmente ácido, que es más adecuado. El efecto de diferentes valores de pH sobre la transmitancia y absorbancia de la solución de alimentación se muestra en la tabla 1.

Como puede verse en la tabla 1, cuando el pH inicial de la reacción es débilmente ácido, la transmitancia y el valor de color de la solución de reacción son mejores que los de la solución con un pH inicial de neutralidad.

En la literatura mencionada, la enzima DPE cataliza la preparación de allosa a partir de fructosa. La disolución de la fructosa debe mantenerse con una solución salina tamponada para estabilizar el valor de pH, lo que conducirá a un aumento de la conductividad de la solución, causando que los subsiguientes procesos de intercambio de aniones y cationes tengan un problema con la disminución en el número de veces que el material puede pasar a través de la resina. La producción Industrial no es fácil de adoptar, y basta disolverla en agua desionizada. Yuan Tangguo et al. [3] y Li Xiaobo et al. [21] lo confirmaron mediante experimentos.

3. 2. 2

La mayoría de las enzimas DPE son enzimas metaldependientes. Incluso si algunos no son dependientes del metal, la presencia de ciertos iones metálicos puede promover en gran medida la velocidad de reacción [21]. Desde la perspectiva de la seguridad alimentaria, es aconsejable elegir iones metálicos como Mg2+ y Mn2+ como aditivos alimentarios para la preparación industrial de enzimas [34~35].

3.2.3 temperatura óptima de la enzima

Los estudios han demostrado que cuanto mayor es la temperatura de reacción, más corta es la vida media de la enzima, pero al mismo tiempo la velocidad de reacción es más rápida y el ciclo de producción se acorta. Desde la perspectiva de la producción industrial, la temperatura óptima de la enzima no es mayor cuanto mejor. Cuanto mayor sea la temperatura, mayor será el consumo de vapor, y es probable que ocurra la reacción de Maillard. Es necesario encontrar un equilibrio entre los dos, y generalmente controlado entre 40 y 60 °C, teniendo en cuenta la producción de otros azúcares funcionales. Cuanto más alta es la temperatura óptima de la enzima, más propicio es para mejorar la tasa de recuperación de la actividad enzimdurante el proceso de extracción de la solución enzimcrude.

3. 3   Concentración de sustradecuada para aplicaciones industriales

El efecto de la concentración de sustrsobre la conversión enzimse muestra en la tabla 2.

Como puede verse en la tabla 2, cuanto menor sea la concentración de la solución de fructosa, más rápida será la conversión en la etapa inicial de la reacción con la misma cantidad de enzima añadi(a la base seca del sustrde reacción). Senembargo, si la concentración es demasiado baja, la cantidad de alulosa producida por unidad de tiempo será demasiado alta. Con la industrialización de la decoloración de alta concentración y el intercambio iónico de alta concentración, la conversión de enzimas de baja concentración a concentración posterior y otros procesos ha aumentado la carga de trabajo. Por lo tanto, en la producción industrial, una concentración de alrededor de (400-500) g/L también puede lograr una alta tasa de conversión, y puede reducir el consumo de agua y energía y reducir las emisiones de carbono.

3. 4 preparación y problemas con los preparados enzimáticos

La velocidad de reacción de la solución enzimes mucho mayor que la de las células enteras. Bajo las mismas condiciones de adición de la enzima, cuando la concentración de la solución de fructosa es de aproximadamente 300 g/L, la velocidad de reacción de la solución de la enzima cruda es de aproximadamente 5 veces la de las células enteras. La enzima DPE es una enzima intracelular, y el proceso de preparación de la solución enzimimplica centrifu, lavado y homogenei. Aunque las soluciones de enzimas crudas o puras pueden prepararse a bajas temperaturas a nivel de laboratorio, es difícil mantener una temperatura baja durante la centrifuy la homogeneidurante la producción industrial. En particular, la pérdida de actividad enzimdurante el proceso de homogeneies relativamente alta, resultando en altos costos de producción de enzimas.

4 perspectivas

La e-allulosa ya ha sido aprobada por regulaciones en 13 países, incluyendo Japón, Corea del sur, Canadá, México, Singapur y Australia. En abril de 2019, la FDA incluso anunció que la d-allulosa sería excluida de las etiquetas de "azúcar añadido" y "azúcar total" [2], lo que significa que la cantidad de d-allululosa añadia los alimentos ya no será restringida en términos de la cantidad añadida. Sin embargo, debido al precio relativamente alto de la celulosa en la actualidad, las ventas no son aún muy grandes. Con la profundización de la investigación y la madurez gradual de la expresión recombinante del huésped de calidad alimentaria de la tecnología clave de la enzima DPE para la d-allulosa, la tasa de conversión de d-allulosa también seguirá mejorando. Las empresas continuarán mejorando los problemas identificados durante la industrialización y las empresas de preparación enzimpondrán en marcha enzimas terminadas.

El coste de preparación de la allulosa disminuirá significativamente La calidad del producto seguirá mejorando. En agosto de 2021, China's la Comisión nacional de salud ha aceptado la solicitud de d-allulosa como nuevo ingrediente alimenticio. Actualmente se están llevando a cabo experimentos toxicol, y se espera que el uso de la alulosa como edulcorse apruebe en la segunda mitad de 2023 o 2024. Dado que la d-allulosa apenas se metaboliza después de pasar a través de los intestinos, no proporciona energía, y tiene efectos fisiológicos únicos tales como reducir efectivamente la glucosa sanguínea postprandial, controlar el peso corporal, y reducir la acumulación de grasa, sus campos de aplicación se harán más y más amplios. En los próximos años, el mercado y la capacidad de la d-celultanto en el país como en el extranjero seguirán expandiéndose y las perspectivas de mercado son buenas.

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