4 métodos de ensayo de Haematococcus Pluvialis astaxantin

astaxantina, chemically named 3,3' dihidroxy-beta,beta'-carotene-4,4'-dione, pertenece a los carotenoides de Keto. Los estudios han demostrado que la astaxantina es el antioxidante natural más fuerte [1-2]. La astaxantina tiene funciones antioxidantes, antirradiación, antienvejecimiento, antitumoral y de prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares [2-3], y por lo tanto tiene un valor económico extremadamente alto. Se ha utilizado en productos para la salud, medicamentos, aditivos alimentarios, cosméticos, alimentos funcionales, aditivos alimentarios y otras áreas [4].

Las principales materias primas para la producción de astaxantina provienen de camarones y conchas de cangrejo [3,5], Haematococcuspluvialis [4] y Rhodotorula glutinis [6]. Entre ellos, Haematococcuspluvialis puede acumular astaxantina hasta el 5% del peso seco en condiciones de estrés. Dado que la estructura de astaxantina contiene dos átomos quirales de C, la estructura en Haematococcus pluvialis es 3S, 3S', y la forma sintética es una mezcla quiral, principalmente 3R, 3R'. Haematococcus pluvialis se considera la mejor fuente de producción natural de astaxantina.

Haematococcus pluvialis forma una pared gelatinosa en forma de concha después de estrés. Cuando se extrae el pigmento en las células, es difícil para los disolventes convencionales entrar en el interior de las células para extraer el pigmento. Por lo general es necesario combinar un método para romper paredes de células. En segundo lugar, la astaxantina en las células de Haematococcus pluvialis existe principalmente en forma de ésteres de astaxantina, es decir, moléculas monoéster de astaxantina y moléculas diéster de astaxantina con diferentes cadenas acilo. El análisis HPLC es difícil de lograr la separación basal de todas las moléculas, y el peso molecular es diferente cuando se calcula el contenido.

Además, astaxantina es inestable y propenso a la degradación en condiciones tales como la luz y el calor, por lo que hay ciertos problemas con la determinación precisa de astaxantina. Este artículo revisa el estado actual de la investigación en términos de la extracción, hidrólisis y detección de astaxantina de Haematococcus pluvialis, con el fende proporcionar orientación sobre la selección de métodos adecuados para la determinación rápida del contenido de astaxantina en Haematococcus pluvialis para diferentes propósitos.

1 extracción de astaxantina de Haematococcus pluvialis

La extracción de astaxantina es la base para la determinación precisa de su contenido y es también uno de los aspectos inciertos de la medición de astaxantina. Bajo condiciones de estrés, las células de Haematococcus pluvialis acumulan astaxantina, pero el crecimiento y la división celular se detienen, formando esporas inmóviles, es decir, células gelatinosas. Las células gelatinosas maduras tienen una pared celular dura y grude de tres capas, siendo la capa más externa la algaenina, un material que es altamente resistente a la hidrólidel ácido acético. La segunda y tercera capas están compuestas de manosa y celuldistribuidas uniformemente y no uniformemente, respectivamente [7].

Para Haematococcus pluvialis con una pared celular gelatinosa, los métodos convencionales de disolución y extracción no pueden acceder al interior de la célula para extraer el pigmento.

At present, enelindustry, supercritical CO2 Extracción de extraccióntechnology [7], high pressure/ultra-high pressure homogenizatIon ionextraction technology [8], yNegativo negativo negativopressure cavitation method [9] are used to Extracto de astaxantinadesdeHaematococcus pluvialis. The above métodoscan effectively Extractos extractos extractosastaxanthin, but they require a large amount dealgal powder yare complicated to operate, so they are suitable paralarge-scale industrial production. The extraction methods used to detect Astaxantina en Haematococcus pluvialis include solvent extraction, mechanical grinding + solvent extraction, dimethyl sulfoxide (DMSO) extraction, ycellulase wall breaking + solvent extraction.

1.1 método de extracción por solvente

El método de extracción por solvente es fácil de operar, de bajo costo y tiene bajos requerimientos de equipo. Solo necesita optimizar el disolvente de extracción, la relación líquido-disolvente, la temperatura de extracción y el tiempo de extracción. Los disolventes de uso común incluyen acetona [10], acetato de etilo, diclorometano, etanol, etc. Sin embargo, debido a la pared exterior de la capa gelatinosa de Haematococcus pluvialis, los disolventes convencionales no pueden entrar en las células, y la tasa de extracción de astaxantina es baja. Mendes-Pinto et al. informaron que la acetona se utilizó como disolvente de extracción para la astaxantina de Haematococcus pluvialis, y la tasa de extracción fue de sólo 4 mg ·g-1 (extrade masa de astaxantina por gramde polvo de algas), mientras que la triturmecánica + extracción de acetona fue de 19 mg ·g-1, lo que indica que el disolvente no podía entrar en las células para extraer astaxantina [10].

Ruen-ngam compared solvent extraction methods assisted by ultrasound (Ultrasound Assisted Extraction), microwave (Microwave Assisted Extraction), ySoxhlet (Soxhlet Extraction). The extraction rate De astaxantinareached 74% usandomicrowave assisted extraction at 75 °C for 5 min [11]. In addition, to enhance elextraction efficiency dethe solvent, chemical cell wall interrupcióninvolves treating Haematococcus pluvialis cells with acids or alkalis. Sarada et al. reported that treating the cells with 2 mol·L-1 hydrochloric acid solution at 70 °C for 2 min, followed by extraction with a solvent, can achieve an Extracción de astaxantina rate de86%–94% [12]. However, it is worth noting that placing astaxantinain a high concentration of acid or alkali solution can easily cause degradation of astaxanthin. The above results show that due to the special cell wall composition of Haematococcus pluvialis, direct solvent extraction cannot enter the cells, while auxiliary ultrasound, microwave and acid-base treatments are all prone to cause degradation De astaxantinaand are not suitable for astaxantinaextraction.

1.2 ruptura mecánica de la pared celular + extracción por solvente

La ruptura mecánica de la pared celular es el método más comúnmente utilizado en el laboratorio, que utiliza fuerzas externas para romper las paredes celulares de Haematococcus pluvialis. En la norma nacional para la detección de astaxantina en Haematococcus pluvialis GB/T 31520-2015 [13], Haematococcus pluvialis se muele a fondo utilizando un homogeneide vidrio, y sus pigse extrautilizando diclorometanmetancomo disolvente. El método de trituración mecánica + extracción por solvente es más comúnmente utilizado en la detección de astaxantina [10,14-16]. La trituración mecánica puede dañar las paredes celulares, y el pigmento puede ser completamente extraído. El método es sencillo de operar, pero este método requiere que cada muestra se muela a través de un homogeneide células, lo que es lento y laborioso.

1.3 alteración de la pared de celulasa + extracción con disolvente

Since the cell wall of Haematococcus pluvialis is mainly composed of substances such as cellulose, pectin and lipopolysaccharides, cellulase, pectinase and polysaccharidase are used to break the cell wall of Haematococcus pluvialis [8]. Zhou Jinke et al. explored a new enzymatic method for extracting astaxantinafrom Haematococcus pluvialis [17]. Cellulase: enzymatic hydrolysis of algal powder, ethanol extraction. The optimal process conditions for enzymatic extraction are: initial pH of the enzymatic solution 4.5, enzymatic hydrolysis temperature 45 °C, enzyme dosage 1.5%, and enzymatic hydrolysis time 15 h. Under these conditions, the astaxanthin extraction rate was 94.6%, which is 61.5% higher than the traditional direct ethanol extraction method. It has the advantages of low operating temperature, less pollution, low cost, and high extraction rate. It is easy to achieve verdeindustrial production, but this method is time-consuming, and high temperatures can also cause degradation of astaxanthin.

1.4 método de extracción DMSO

El DMSO tiene una buena miscibilidad con varios disolventes y una buena permeabilidad a las células. A menudo se utiliza como un potencide la permede medicamentos o pesticidas y como agente protector en la criopreservación de células. Seely informó por primera vez que el DMSO puede ser utilizado para extraer clorofila microalgal y carotenoides [18]. Boussiba et al. usaron DMSO para extraer los pigmentos de Haematococcus pluvialis. La extracción se llevó a cabo en un baño de agua de 70 °C durante 10 min, y el residuo de algas se puede hacer incoloro repila extracción 2 a 3 veces en un baño de agua de 70 °C [19], lo que muestra que el DMSO tiene buena permeabilidad y puede penetrar en las células de Haematococcus pluvialis para extraer completamente astaxantina. La extracción de DMSO no requiere tratamiento de las paredes celulares de Haematococcus pluvialis, simplienormemente el proceso de extracción de astaxantina, y se ha utilizado en la detección de astaxantina [20-21]. Además, the world's empresas líderes de microalgas, como Cyanotech, Fuji en Japón, y China's Green A Bioengineering Company [8], han aplicado el método DMSO para extraer astaxantina de Haematococcus pluvialis para la detección de astaxantina.

El uso de DMSO como un agente de hinchazón puede aumentar la permeabilidad de la pared celular, y puede ser utilizado como un extractante para astaxantina de Haematococcus pluvialis, simplificando el proceso de romper la pared celular requerido en la detección de Haematococcus pluvialis.

2 hidrólide los ésteres de astaxantina

La astaxantina acumulada en Haematococcus pluvialis es all-trans 3S, 3S 'configuration, with one hydroxyl group in each endocyclic structure. It is usually esterified with C16, C18 or C20 fatty acids to form Ésteres de astaxantina to stabilize its structure [22]. Most of them are astaxanthin monoesters, accounting for about 75%, astaxanthin diésteresaccounting for about 20%, and free astaxanthin only accounting for 5% [12, 23]. There are as many as 30 different types of astaxanthin monoesters and diesters in Haematococcus pluvialis [24]. The complexity of astaxanthin esters makes purification and direct and accurate cuanticuanticuanticuantiproblematic. Therefore, the extracted astaxanthin esters need to be hydrolyzed into free astaxanthin to achieve purification of a single substance and accurate quantification by HPLC. There are generally two methods for hydrolyzing astaxanthin esters: saponification and enzymatic hydrolysis.

2.1 saponificación

La saponificación se lleva a cabo generalmente en una solución de metanmetannaoh o KOH para hidrolizar los ésteres de astaxantina en astaxantina libre. Yuan et al. mostraron que una alta concentración alcalina o temperatura de reacción durante la saponificación es propicio para la hidrólisis de los ésteres de astaxantina, pero también acelera la degradación de astaxantina [14]. Chen Xingcai et al. también mostraron que la concentración de astaxantina libre disminuyó linealmente con el aumento de la concentración de álcali [25]. Yuan et al. estudiaron la cinética de hidrólisis de astaxantina bajo éster saponificación y la degradación de astaxantina bajo diferentes concentraciones alcalinas. Los resultados mostraron que en un sistema de reacción de 22 °C con una concentración de NaOH de 0.0175~0.020 mol · L-1, el éster de astaxantina fue completamente hidrolizado y no se produjo degradación de astaxantina. Sin embargo, una mayor concentración de la solución de naoh-metanol o una temperatura de reacción más alta causó una degradación significativa de astaxantina [26]. Las condiciones del método de saponificación para los ésteres de astaxantina son duras. La concentración de la solución alcalina, la temperatura de saponificación y el tiempo durante el proceso de saponificación afectan a la eficiencia de la saponificación y la estabilidad de astaxantina, que es otro aspecto que afecta a la determinación precisa de astaxantina.

2.2 método de hidrólienzim.

Zhao reported that a water-soluble alkaline esterase from Penicilium cyclopium can convert astaxanthin esters into astaxanthin. The reaction conditions were incubation at 28 °C with stirring for 7 h, and the recuperaciónof astaxanthin reached 63.2% [27]. However, this enzyme has low hydrolysis efficiency and has not been widely used in the determination of astaxanthin content. Jacobs first reported that the lipid-soluble cholesterol esterase can rapidly hydrolyze carotenoid esters [28]. Although there are currently few reports in the literature on this enzymatic method, it is used by domestic and foreign companies producing astaxanthin as a gentle method of hydrolysis. The cholesterol esterase used not only completely hydrolyzes the astaxanthin ester, but also does not easily cause oxidation of astaxanthin, which can more accurately determine the astaxanthin content.

El uso de esterasa de colesterol en extracto de Haematococcus pluvialis que contiene astaxantina durante un corto período de tiempo mejora en gran medida la eficiencia de detección de astaxantina en Haematococcus pluvialis.

3 detección cuantitativa de astaxantina en Haematococcus pluvialis

Los principales métodos para detectar astaxantina son espectrofotometría, hidrolisis-hplc, y HPLC-MS.

3.1 espectrofotometría

Boussiba reported that chlorophyll in Haematococcus pluvialis was destroyed by heating with 5% KOH-30% methanol solution for about 10 minutes, and then the astaxanthin was extracted with DMSO. The absorbance was measured at a wavelength of 475 nm to calculate the astaxanthin concentration. This method can quickly estimate the astaxanthin content and is widely used in cultivation and production [12, 29]. However, some reports have shown that the treatment of the alkali solution to destroy the chlorophyll in this method causes 25% to 40% degradation of astaxanthin [16].

Por lo tanto, Li et al. mejoraron Boussiba's método mediante la extracción directa de DMSO sin tratamiento alcalino, y la detección en una longitud de onda de luz visible de 530 nm para evitar la interferencia de otros carotenoides y clorofila. Este método fue utilizado para la rápida detección del contenido de astaxantina en Haematococcus pluvialis [16]. Geng Jinfeng&#La investigación muestra que el contenido de carotenoides y astaxantina en Haematococcus pluvialis durante el proceso de cultivo está en una relación lineal estable. Usando un método que mide directa y fácilmente los carotenoides e indirectamente obtiene el contenido de astaxantina, el contenido de carotenoides se puede determinar rápidamente, y luego basado en la correlación entre los carotenoides obtenidos y astaxantina, el contenido de astaxantina en Haematococcus pluvialis se puede calcular rápidamente. Los datos de este laboratorio también muestran que existe una buena relación lineal entre el contenido de carotenoides medido por espectrofotometría y el contenido de astaxantina medido por hidrolisis enzimhplc (figura 1), por lo que el método de extracción DMSO puede usarse directamente para determinar el contenido de astaxantina utilizando el método espectrofotométrico a 475 nm y la relación en la figura 1.

3.2 método hidrolisis-hplc

After the Haematococcus pluvialis pigment is pretreated by saponification or enzymatic hydrolysis, HPLC can be used to accurately determine the free astaxanthin. At present, the national standard for astaxanthin determination GB/T 31520-2015 uses the method of HPLC after saponification for determination [13]. The separation column is a reverse-phase C30 column, and the detection of all-trans-free astaxanthin, 9-cis- astaxanthin, and 13-cis-astaxanthin can be detected in 20 min. Yuan used a C18 column to analyze astaxanthin esterified with saponin. Methanol/dichloromethane/acetonitrile/water was used as the mobile phase for gradient elution, and a single sample was detected in 16 min [30]. Cyanotech&#El método para determinar el contenido de Haematococcus pluvialis es extraer el pigmento y luego hidrolizarlo para la determinación de HPLC. Este pretratamiento por hidróliconvierte los ésteres de astaxantina en astaxantina, que convierte los componentes mezclque contienen compuestos de astaxantina en la detección de un solo componente de astaxantina, haciendo el análisis HPLC más simple, permitiendo una cuantiprecisa, y con alta repetibilidad. En la tabla 1 se resumen más condiciones de separación por cromatode fase reversa de astaxantina.

3.3 método HPLC-MS

Debido a la diversidad y complejidad de la extracción de astaxantina y sus derivados de éster, los métodos convencionales de espectrofotometría y HPLC no pueden identificar las diferencias entre las diferentes moléculas de éster de astaxantina. La espectrode masas puede distinguir mejor entre diferentes moléculas mediante el uso de las diferencias en la información de masa y fragmento entre las moléculas de éster de astaxantina, y luego llevar a cabo análisis cualitativos y cuantitativos. El método de medición directa de la muestra de pigmento extraído por HPLC/MS sin tratamiento evita la degradación de astaxantina durante el proceso de saponificación, y puede medir simultáneamente astaxantina, astaxantina ésteres, otros carotenoides y clorofila.

Tiene ciertas aplicaciones en la determinación de la composición de astaxantina y el estudio de los mecanismos metabólicos de astaxantina. Holtin et al. usaron LC-(APCI)MS para analizar cualitisómeros libres de astaxantina, monoésteres de astaxantina, diésteres de astaxantina y luteína en Haematococcus pluvialis [24]. Weesepoel et al. usaron ESI-IT y MADIL-TOF/TOF para realizar un análisis más detallado de los ésteres de astaxantina en Haematococcus pluvialis, incluyendo la determinación de la cadena acilo de éster de astaxantina y la distinción entre los isómeros cis y trans [32]. En la tabla 1 se resumen más separaciones cromatográficas de astaxantina y sus derivados de éster. Vale la pena señalar que la baja polaridad de los carotenoides y los ésteres de astaxantina hace que sea difícil de ioniutilizando la fuente de iones ESI de ionisuave de uso común. La fuente de iones se utiliza más comúnmente para el análisis de ésteres de astaxantina.

Este trabajo revisa y evalúa los métodos actuales para la extracción, hidróliy detección deastaxanthin in Haematococcus pluvialis. El contenido de astaxantina se mide directamente por espectrofotometría en una longitud de onda de 475 nm después de la extracción con DMSO. El contenido de astaxantina se calcula rápidamente sobre la base de la relación lineal entre el contenido de carotenoides medido por espectrofotometría y el contenido de astaxantina medido por HPLC. Este método es más propicio para obtener rápidamente parámetros importantes durante la investigación. Después de la extracción de DMSO, la esterasa de colesterol se utiliza para la hidrólisis, y HPLC se utiliza para determinar el contenido de astaxantina libre, que puede ser utilizado como un método para determinar con precisión el contenido de astaxantina. Para diferentes fines de detección, se pueden utilizar diferentes métodos para el análisis, y la comparación de datos entre diferentes laboratorios o métodos debe corregirse a los resultados después del tratamiento de hidrólisis de la muestra extray el análisis HPLC.

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