4 métodos de ensayo de Haematococcus Pluvialis astaxantin

Astaxantina, quínombrado 3,3' dihidroxy-beta,beta'-carotene-4,4'-dione, pertenece a los carotenoides de Keto. Los estudios han demostrado que la astaxantina es el antioxidante natural más fuerte [1-2]. La astaxantina tiene funciones antioxidantes, antirradiación, antienvejecimiento, antitumoral y de prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares [2-3], y por lo tanto tiene un valor económico extremadamente alto. Se ha utilizado en productos para la salud, medicamentos, aditivos alimentarios, cosméticos, alimentos funcionales, aditivos alimentarios y otras áreas [4].

Las principales materias primas para la producción de astaxantina provienen de camarones y conchas de cangrejo [3,5], Haematococcuspluvialis [4] y Rhodotorula glutinis [6]. Entre ellos, Haematococcuspluvialis puede acumular astaxantina hasta el 5% del peso seco en condiciones de estrés. Dado que la estructura de astaxantina contiene dos átomos quirales de C, la estructura en Haematococcus pluvialis es 3S, 3S', y la forma sintética es una mezcla quiral, principalmente 3R, 3R'. Haematococcus pluvialis se considera la mejor fuente de producción natural de astaxantina.

Haematococcus pluvialis forma una pared gelatinosa en forma de concha después de estrés. Cuando se extrae el pigmento en las células, es difícil para los disolventes convencionales entrar en el interior de las células para extraer el pigmento. Por lo general es necesario combinar un método para romper paredes de células. En segundo lugar, la astaxantina en las células de Haematococcus pluvialis existe principalmente en forma de ésteres de astaxantina, es decir, moléculas monoéster de astaxantina y moléculas diéster de astaxantina con diferentes cadenas acilo. El análisis HPLC es difícil de lograr la separación basal de todas las moléculas, y el peso molecular es diferente cuando se calcula el contenido.

Además, astaxantina es inestable y propenso a la degradación en condiciones tales como la luz y el calor, por lo que hay ciertos problemas con la determinación precisa de astaxantina. Este artículo revisa el estado actual de la investigación en términos de extracción, hidrólisis y detección deAstaxantina de Haematococcus pluvialisCon el fende proporcionar orientación sobre la selección de métodos adecuados para la determinación rápida del contenido de astaxantina en Haematococcus pluvialis para diferentes fines.

1 extracción de astaxantina de Haematococcus pluvialis

La extracción de astaxantina es la base para la determinación precisa de su contenido y es también uno de los aspectos inciertos de la medición de astaxantina. Bajo condiciones de estrés, las células de Haematococcus pluvialis acumulan astaxantina, pero el crecimiento y la división celular se detienen, formando esporas inmóviles, es decir, células gelatinosas. Las células gelatinosas maduras tienen una pared celular dura y grude de tres capas, siendo la capa más externa la algaenina, un material que es altamente resistente a la hidrólidel ácido acético. La segunda y tercera capas están compuestas de manosa y celuldistribuidas uniformemente y no uniformemente, respectivamente [7].

Para Haematococcus pluvialis con una pared celular gelatinosa, los métodos convencionales de disolución y extracción no pueden acceder al interior de la célula para extraer el pigmento.

En la actualidad, en la industria, la tecnología de extracción de CO2 supercrítica [7], la tecnología de extracción de homogeneia alta presión/ultraalta presión [8] y el método de cavitación a presión negativa [9] se utilizan para extraer astaxantina de Haematococcus pluvialis. Los métodos anteriores pueden extraer eficazmente astaxantina, pero requieren una gran cantidad de polvo de algas y son complicados de operar, por lo que son adecuados para la producción industrial a gran escala. Los métodos de extracción utilizados para detectar astaxantina en Haematococcus pluvialis incluyen extracción con disolvente, molido mecánica + extracción con disolvente, extracción con dimetilsulfóxido (DMSO) y ruptura de pared de celulasa + extracción con disolvente.

1.1 método de extracción por solvente

El método de extracción por solvente es fácil de operar, de bajo costo y tiene bajos requerimientos de equipo. Solo necesita optimizar el disolvente de extracción, la relación líquido-disolvente, la temperatura de extracción y el tiempo de extracción. Los disolventes de uso común incluyen acetona [10], acetato de etilo, diclorometano, etanol, etc. Senembargo, debido a la pared exterior de la capa gelatinosa de Haematococcus pluvialis, los disolventes convencionales no pueden entrar en las células, y la tasa de extracción de astaxantina es baja. Mendes-Pinto et al. informaron que la acetona se utilizó como disolvente de extracción para la astaxantina de Haematococcus pluvialis, y la tasa de extracción fue de sólo 4 mg ·g-1 (extrade masa de astaxantina por gramde polvo de algas), mientras que la triturmecánica + extracción de acetona fue de 19 mg ·g-1, lo que indica que el disolvente no podía entrar en las células para extraer astaxantina [10].

Ruen-ngam comparó métodos de extracción por solvente asistido por ultrasonido (extracción asistida por ultrasonido), microondas (extracción asistida por microondas), y Soxhlet (extracción Soxhlet). La tasa de extracción de astaxantina alcanzó el 74% utilizando la extracción asistida por microondas a 75 °C durante 5 min [11]. Además, para mejorar la eficiencia de extracción del disolvente, la alteración química de la pared celular implica el tratamiento de las células de Haematococcus pluvialis con ácidos o álcalis. Sarada et al. reportaron que el tratamiento de las células con 2 mol·L-1 solución de ácido clorhídrico a 70 °C durante 2 min, seguido de extracción con un solvente, puede lograr una tasa de extracción de astaxantina de 86%-94% [12]. Sin embargo, vale la pena señalar que la colocación de astaxantina en una alta concentración de ácido o solución alcalina puede causar fácilmente la degradación de astaxantina. Los resultados anteriores muestran que debido a la especial composición de la pared celular de Haematococcus pluvialis, la extracción directa con disolvente no puede entrar en las células, mientras que los tratamientos auxiliares de ultrasonido, microondas y ácibase son propensos a causar la degradación de astaxantina y no son adecuados para la extracción de astaxantina.

1.2 ruptura mecánica de la pared celular + extracción por solvente

La ruptura mecánica de la pared celular es el método más comúnmente utilizado en el laboratorio, que utiliza fuerzas externas para romper las paredes celulares de Haematococcus pluvialis. En la norma nacional para la detección deAstaxantina en Haematococcus pluvialisGB/T 31520-2015 [13], Haematococcus pluvialis se muele a fondo usando un homogeneide vidrio, y sus pigmentos se extrautilizando diclorometanmetancomo disolvente. El método de trituración mecánica + extracción por solvente es más comúnmente utilizado en la detección de astaxantina [10,14-16]. La trituración mecánica puede dañar las paredes celulares, y el pigmento puede ser completamente extraído. El método es sencillo de operar, pero este método requiere que cada muestra se muela a través de un homogeneide células, lo que es lento y laborioso.

1.3 alteración de la pared de celulasa + extracción con disolvente

Dado que la pared celular de Haematococcus pluvialis se compone principalmente de sustancias como celul, pectina y lipopolisacáridos, celulasa, pectinasa y polisacaridasa se utilizan para romper la pared celular de Haematococcus pluvialis [8]. Zhou Jinke et al. exploraron un nuevo método enzimpara la extracción de astaxantina de Haematococcus pluvialis [17]. Celul: hidrólienzimde polvo de algas, extracción de etanol. Las condiciones óptimas de proceso para la extracción enzimson: pH inicial de la solución enzim4,5, temperatura de hidrólisis enzim45 °C, dosis enzim1,5% y tiempo de hidrólienzim15 h. En estas condiciones, la tasa de extracción de astaxantina fue del 94,6%, un 61,5% superior al método tradicional de extracción directa de etanol. Tiene las ventajas de baja temperatura de operación, menos contaminación, bajo costo y alta tasa de extracción. Es fácil lograr la producción industrial verde, pero este método es lento, y las altas temperaturas también pueden causar la degradación de astaxantina.

1.4 método de extracción DMSO

El DMSO tiene una buena miscibilidad con varios disolventes y una buena permeabilidad a las células. A menudo se utiliza como un potencide la permede medicamentos o pesticidas y como agente protector en la criopreservación de células. Seely informó por primera vez que el DMSO puede ser utilizado para extraer clorofila microalgal y carotenoides [18]. Boussiba et al. usaron DMSO para extraer los pigmentos de Haematococcus pluvialis. La extracción se llevó a cabo en un baño de agua de 70 °C durante 10 min, y el residuo de algas se puede hacer incoloro repila extracción 2 a 3 veces en un baño de agua de 70 °C [19], lo que muestra que el DMSO tiene buena permeabilidad y puede penetrar en las células de Haematococcus pluvialis para extraer completamente astaxantina. La extracción de DMSO no requiere tratamiento de las paredes celulares de Haematococcus pluvialis, simplienormemente el proceso de extracción de astaxantina, y se ha utilizado en la detección de astaxantina [20-21]. Además, elworld's empresas líderes de microalgas, como Cyanotech, Fuji en Japón, y China's Green A Bioengineering Company [8], han aplicado el método DMSO para extraer astaxantina de Haematococcus pluvialis para la detección de astaxantina.

El uso de DMSO como un agente de hinchazón puede aumentar la permeabilidad de la pared celular, y puede ser utilizado como un extractante para astaxantina de Haematococcus pluvialis, simplificando el proceso de romper la pared celular requerido en la detección de Haematococcus pluvialis.

2 hidrólide los ésteres de astaxantina

La astaxantina acumulada en Haematococcus pluvialis es all-trans 3S, 3S ' configuración, con un grupo hidroxilo en cada estructura. Usualmente se esterifica con ácidos grasos C16, C18 o C20 para formar ésteres de astaxantina para estabilizar su estructura [22]. La mayoría de ellos son monoésteres de astaxantina, representando alrededor del 75%, los diésteres de astaxantina representan alrededor del 20%, y la astaxantina libre solo representa el 5% [12,23]. Hay hasta 30 tipos diferentes de monoésteres y diésteres de astaxantina en Haematococcus pluvialis [24]. La complejidad de los ésteres de astaxantina hace que la purificación y la cuantidirecta y precisa sean problemáticas. Por lo tanto, los ésteres de astaxantina extraídos necesitan ser hidrolizados en astaxantina libre para lograr la purificación de una sola sustancia y la cuantiprecisa por HPLC. Generalmente hay dos métodos para hidrolizar los ésteres de astaxantina: saponificación e hidrólienzim.

2.1 saponificación

La saponificación se lleva a cabo generalmente en una solución de metanmetannaoh o KOH para hidrolizar los ésteres de astaxantina en astaxantina libre. Yuan et al. mostraron que una alta concentración alcalina o temperatura de reacción durante la saponificación es propicio para la hidrólisis de los ésteres de astaxantina, pero también acelera la degradación de astaxantina [14]. Chen Xingcai et al. también mostraron que la concentración de astaxantina libre disminuyó linealmente con el aumento de la concentración de álcali [25]. Yuan et al. estudiaron la cinética de hidrólisis de astaxantina bajo éster saponificación y la degradación de astaxantina bajo diferentes concentraciones alcalinas. Los resultados mostraron que en un sistema de reacción de 22 °C con una concentración de NaOH de 0.0175~0.020 mol · L-1, el éster de astaxantina fue completamente hidrolizado y no se produjo degradación de astaxantina. Sin embargo, una mayor concentración de la solución de naoh-metanol o una temperatura de reacción más alta causó una degradación significativa de astaxantina [26]. Las condiciones del método de saponificación para los ésteres de astaxantina son duras. La concentración de la solución alcalina, la temperatura de saponificación y el tiempo durante el proceso de saponificación afectan a la eficiencia de la saponificación y la estabilidad de astaxantina, que es otro aspecto que afecta a la determinación precisa de astaxantina.

2.2 método de hidrólienzim.

Zhao informó que una esterasa alcalalcalsoluble en agua de Penicilium cyclopium puede convertir los ésteres de astaxantina en astaxantina. Las condiciones de reacción fueron incubación a 28 °C con agitación durante 7 h, y la recuperación de astaxantina alcanzó el 63,2% [27]. Sin embargo, esta enzima tiene una baja eficiencia de hidróliy no ha sido ampliamente utilizada en la determinación del contenido de astaxantina. Jacobs informó por primera vez que la liposoluble esterasa colesterol puede hidrolizar rápidamente los ésteres carotenoides [28]. Aunque actualmente hay pocos informes en la literatura sobre este método enzim, es utilizado por empresas nacionales y extranjeras que producen astaxantina como un método suave de hidrólisis. La esterasa de colesterol utilizado no sólo hidroliza completamente el éster astaxantina, pero también no causa fácilmente la oxidde astaxantina, que puede determinar con mayor precisión el contenido de astaxantina.

El uso de esterasa de colesterol en extracto de Haematococcus pluvialis que contiene astaxantina durante un corto período de tiempo mejora en gran medida la eficiencia de detección de astaxantina en Haematococcus pluvialis.

3 detección cuantitativa de astaxantina en Haematococcus pluvialis

Los principales métodos para detectar astaxantina son espectrofotometría, hidrolisis-hplc, y HPLC-MS.

3.1 espectrofotometría

Boussiba informó que la clorofila en Haematococcus pluvialis fue destruida por calentamiento con 5% KOH-30% de solución de metandurante unos 10 minutos, y luego la astaxantina fue extraída con DMSO. La absorbancia se midió en una longitud de onda de 475 nm para calcular la concentración de astaxantina. Este método puede estimar rápidamente el contenido de astaxantina y es ampliamente utilizado en cultivo y producción [12,29]. Sin embargo, algunos informes han demostrado que el tratamiento de la solución alcalina para destruir la clorofila en este método causa de 25% a 40% de degradación de astaxantina [16].

Por lo tanto, Li et al. mejoraron Boussiba's método mediante la extracción directa de DMSO sin tratamiento alcalino, y la detección en una longitud de onda de luz visible de 530 nm para evitar la interferencia de otros carotenoides y clorofila. Este método fue utilizado para la rápida detección del contenido de astaxantina en Haematococcus pluvialis [16]. Geng Jinfeng&#La investigación muestra que el contenido de carotenoides y astaxantina en Haematococcus pluvialis durante el proceso de cultivo está en una relación lineal estable. Usando un método que mide directa y fácilmente los carotenoides e indirectamente obtiene el contenido de astaxantina, el contenido de carotenoides se puede determinar rápidamente, y luego basado en la correlación entre los carotenoides obtenidos y astaxantina, el contenido de astaxantina en Haematococcus pluvialis se puede calcular rápidamente. Los datos de este laboratorio también muestran que existe una buena relación lineal entre el contenido de carotenoides medido por espectrofotometría y el contenido de astaxantina medido por hidrolisis enzimhplc (figura 1), por lo que el método de extracción DMSO puede usarse directamente para determinar el contenido de astaxantina utilizando el método espectrofotométrico a 475 nm y la relación en la figura 1.

3.2 método hidrolisis-hplc

Después de que el pigmento de Haematococcus pluvialis es pretratado por saponificación o hidrólienzim, HPLC se puede utilizar para determinar con precisión la astaxantina libre. En la actualidad, la norma nacional para la determinación de astaxantina GB/T 31520-2015 utiliza el método de HPLC después de saponificación para la determinación [13]. La columna de separación es una columna de C30 de fase inversa, y la detección de todo-trans-libre astaxantina, 9-cis- astaxantina, y 13-cis-astaxantina se puede detectar en 20 min. Yuan utilizó una columna de C18 para analizar astaxantina esterificada con saponina. Se utilizó metan/ diclorometano/acetonitrilo/agua como fase móvil para la elugradiente, y se detectó una sola muestra en 16 min [30]. Cyanotech&#El método para determinar el contenido de Haematococcus pluvialis es extraer el pigmento y luego hidrolizarlo para la determinación de HPLC. Este pretratamiento por hidróliconvierte los ésteres de astaxantina en astaxantina, que convierte los componentes mezclque contienen compuestos de astaxantina en la detección de un solo componente de astaxantina, haciendo el análisis HPLC más simple, permitiendo una cuantiprecisa, y con alta repetibilidad. En la tabla 1 se resumen más condiciones de separación por cromatode fase reversa de astaxantina.

3.3 método HPLC-MS

Debido a la diversidad y complejidad de la extracción de astaxantina y sus derivados de éster, los métodos convencionales de espectrofotometría y HPLC no pueden identificar las diferencias entre las diferentes moléculas de éster de astaxantina. La espectrode masas puede distinguir mejor entre diferentes moléculas mediante el uso de las diferencias en la información de masa y fragmento entre las moléculas de éster de astaxantina, y luego llevar a cabo análisis cualitativos y cuantitativos. El método de medición directa de la muestra de pigmento extraído por HPLC/MS sin tratamiento evita la degradación de astaxantina durante el proceso de saponificación, y puede medir simultáneamente astaxantina, astaxantina ésteres, otros carotenoides y clorofila.

Tiene ciertas aplicaciones en la determinación de la composición de astaxantina y el estudio de los mecanismos metabólicos de astaxantina. Holtin et al. usaron LC-(APCI)MS para analizar cualitisómeros libres de astaxantina, monoésteres de astaxantina, diésteres de astaxantina y luteína en Haematococcus pluvialis [24]. Weesepoel et al. usaron ESI-IT y MADIL-TOF/TOF para realizar un análisis más detallado de los ésteres de astaxantina en Haematococcus pluvialis, incluyendo la determinación de la cadena acilo de éster de astaxantina y la distinción entre los isómeros cis y trans [32]. En la tabla 1 se resumen más separaciones cromatográficas de astaxantina y sus derivados de éster. Vale la pena señalar que la baja polaridad de los carotenoides y los ésteres de astaxantina hace que sea difícil de ioniutilizando la fuente de iones ESI de ionisuave de uso común. La fuente de iones se utiliza más comúnmente para el análisis de ésteres de astaxantina.

Este trabajo revisa y evalúa los métodos actuales para la extracción, hidróliy detección deAstaxantina en Haematococcus pluvialis. El contenido de astaxantina se mide directamente por espectrofotometría en una longitud de onda de 475 nm después de la extracción con DMSO. El contenido de astaxantina se calcula rápidamente sobre la base de la relación lineal entre el contenido de carotenoides medido por espectrofotometría y el contenido de astaxantina medido por HPLC. Este método es más propicio para obtener rápidamente parámetros importantes durante la investigación. Después de la extracción de DMSO, la esterasa de colesterol se utiliza para la hidrólisis, y HPLC se utiliza para determinar el contenido de astaxantina libre, que puede ser utilizado como un método para determinar con precisión el contenido de astaxantina. Para diferentes fines de detección, se pueden utilizar diferentes métodos para el análisis, y la comparación de datos entre diferentes laboratorios o métodos debe corregirse a los resultados después del tratamiento de hidrólisis de la muestra extray el análisis HPLC.

Referencia:

[1]Kobayashi M,Sakamoto Y. Singlet Oxygen quenching ability De astaxantinaésteresdesdeelverdealgaHaematococcus pluvialis[J]. Biotechnology Letters,1999,21(4):265-269.

[2]Naguib Y M A. antioxidante actividades deastaxantina y relacionados Carotenoides [J]. revista FEOGA y Food Chemistry,2000,48(4):1150-1154.

[3]Higuera-Ciapara I, félix-valenzuela L,Goycoolea F M. astaxantina :A review deITS Chemistry yapplications[J]. Critical Reviews in Food Science yNutrition,2006,46(2):185-196.

[4] cuellar-bermúdez S P, aguilar-hernández I, cárdenas-chávez D L,et al.extracción y purificación de metabolide alto valor

A partir de microalgas: lípidos esenciales, astaxantina y ficobiliproteínas [J]. Microbial Biotechnology,2015,8(2):190-209.

[5]Lin W C,Chien J T,Chen B h.determinación de carotenoides en conchas de camarón lanza (Parapenaeopsis hardwickii) por cromatolíquida [J]. Journal deAgricultural and Food Chemistry,2005,53(13):5144-5149.

[6] Ni Hui, Hong Qinglin, Xiao Anfeng, et al. Rendimiento productivo de una cepa de alto rendimiento de astaxantina de Pichia pastoris [J]. Chinese Journal of Bioengineering, 2011, 27(7): 1065-1075.

[7]Kim D-Y,Vijayan Praveenkumar R,et Al. Cell-wall interrupción Y lípidos/astaxantina Extracción de microalgas: Clorella y Haematococcus[J]. Bioresource Technology,2016,199:300-310.

[8] Yu Shaolei, Du Weichun, Yao Qiao, et al. Investigación de procesos sobre la hidrólisis enzimcombinada con un método físico para el tratamiento rommuros de Haematococcus pluvialis [J]. Food Engineering, 2016 (4): 38-40.

[9] Zu Yuangang, Liu Lina, Xue Yanhua, et al. Extracción de astaxantina por método de cavitación a presión negativa [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2007, 35(2): 59-60.

[10]Mendes-Pinto M M,Raposo M F J,Bowen Jet al. EvaluatIon ionof different cell disrupprocesses on encysted cells of Haematococcus pluvialis:effects on astaxantinaRecovery and implications parabio-available [J]. Journal of Applied Phycology,2001,13(1):19-24.

[11]Ruen-ngam D,Shotipruk A,Pavasant P. comparación of  Extracción de extracción métodos for  recuperación of  astaxantina De Haematococcus pluvialis[J]. Ciencia y tecnología de separación,2011,46(1):64-70.

[12]Sarada R,Vidhyavathi R,Usha D,et al.un método eficiente para la extracción de astaxantina de alga verde Haematococcus pluvialis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(20):7585-7588.

[13] GB/T 31520-2015. Determinación de astaxantina en Haematococcus pluvialis - método de cromatolíquida [P]. China, 2015.

[14] Yuan J P,Chen F. separación cromatográfica y purificación de trans-astaxantina de los extractos de Haematococcus pluvialis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(8):3371-3375.

[15] Sun Weihong, Xiao Ronghui, Leng Kailiang, et al. Método de cromatolíquida de alto rendimiento en fase C30 revertida para la determinación de astaxantina en Haematococcus pluvialis [J]. Journal of Analytical Testing, 2010, 29 (8): 841-845.

[16] [16]Li Y,Miao F,Geng aún Al. Exacto cuanticuanticuanticuanti De astaxantina from  Haematococcus  crucrucru Extractos extractos extractos Espectrofoto-metrically [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2012,30(4):627-637.

[17] Zhou Jinke, Li Jinhua, Ge Fahuan, et al. Investigación sobre un nuevo método enzimático para la extracción de astaxantina de Haematococcus pluvialis [J]. China Materia Medica, 2008, 31(9): 1423-1425.

[18] Seely G R,Vidaver W E,Duncan M j.preparación y extracción analítica de pigmentos de algas pardas con dimetilsulfóxido [J]. Marine Biology,1972,12(2):184-188.

[19]Boussiba S,Vonshak A. Astaxanthin Acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación acumulación in  the  green  alga  Haematococcus  Pluvialis [J]. La planta and   Cell Physiology,1991,32(7):1077-1082.

[20]Orosa M,Franqueira D,Cid A,et al.análisis y aumento de la acumulación de astaxantina en Haematococcus pluvialis [J]. Bioresource Technology,2005,96(3):373-378.

[21]Boussiba S,Bing W,Yuan J P,et al. Cambios en el perfil de pigmentos en el alga verde Haeamtococcus pluvialis expuesto a tensiones ambientales [J]. Biotechnology Letters,1999,21(7):601-604.

[22]Breithaupt D e.identificación y cuantide ésteres de astaxantina en camarón (Pandalus borealis) y en un microalga (Haematococcus Pluvialis) por Líquido líquido líquido líquido líquido líquido líquido líquido líquido líquido líquido líquido líquido cromatocromatocromatografía masa espectroespectroespectroespectro usando Negativo negativo negativo ion  atmosférico Ioniioniquímica a presión [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(12):3870-3875.

[23]Miao F P,Lu D Y,Li Y G,et al.caracterización de astaxantinthinesters en Haematococcus pluvialis por cromatolíquida -

Espectrode masas de ioniioniquímica de presión atmosférica atmosférica [J]. Analytical Biochemistry,2006,352(2):176-181.

[24]Holtin K,Kuehnle M,Rehbein J,et  Al. Determinación of  astaxanthin  and  astaxanthin  esters  in  the   Microalgas Haematococcus pluvialis por LC-(APCI)MS y caracterización de los isómeros carotenoides predominantes por espectroscopia de RMN [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2009,395(6):1613-1622.

[25] Chen Xingcai, Huang Weiguang, Ouyang Qin. Saponificación de esteres de astaxantina y purificación y separación de astaxantina libre de Haematococcus pluvialis [J]. Journal of Fuzhou University (Natural Science Edition), 2005, 33 (2): 264-268.

[26] Yuan J P,Chen F. hidrólikineticsofastaxantthinesters and stability ofastaxanthin of Haematococcus pluvialis during saponification[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1999,47(1):31-35.

[27]Zhao Y,Guan F,Wang G,et al.preparación de astaxantina por hidrólide sus ésteres catpor lisis a partir de extractos de algas de Haematococcus pluvialis [J]. Journal of Food Science,2011,76(4):C643-C650.

[28]Jacobs P B,Leboeuf R D McCommas S A,et al. escisión de ésteres carotenoides por colesterol esterasa [J]. Bioquímica comparativa y fisibioquímica b-bioquímica & Biología Molecular,1982,72(1):157-160.

[29] Geng Jinfeng, Zhang Huimin, Yang Jianqiang, et al. Un método rápido para la determinación del contenido de astaxantina en Haematococcus pluvialis [J]. Food Research and Development, 2016, 37(12): 125-128.

[30] Yuan J P,Chen F.Identification of astaxanthin isomers in Haematococcus lacustris by HPLC-photodiode array detection [J]. Técnicas de biotecnología,1997,11(7):455-459.

[31]Peng J,Xiang W,Tang Q,et al.análisis comparativo de astaxantina y sus ésteres en el mutante E1 de Haematococcus pluvialis y otras algas verdes por HPLC con una columna C30 [J]. Science in China Series C-Life Sciences,2008,51(12):1108-1115.

[32]Weesepoel Y,Vincken J-P,Pop R M,et al.sodiación como una herramienta para mejorar el valor diagnóstico de los espectros de MALDI-TOF/TOF-MS de mezclas complejas de éster de astaxantina de Haematococcus pluvialis[J]. Journal of Mass spectro, 2013, 48(7):862-874.