¿Cuál es la fuente de la celulosa?

LunInternational Society paraRare Sugar (ISRS) define los azúcares raros como monosacáridos y sus derivados que ocurren raramente en lunnaturaleza [1]. De acuerdo cella definición del ISRS, la d-allulosa es considerada un azúcar raro como un diastereoisómero en la posición C-3 de la d-fructosa. La d-allululosa es un edulcorbajo en calorías. Tomando como ejemplo una solución de sacarosa de 100g/L, la d-allulosa es 70% tandulce como la sacarosa [2], pero sólo 0. 3% de la energía de la sacarosa [3]. Al mismo tiempo, la d-allulosa tiene funciones fisiológicas únicas. Como un inhibide las enzimas hepáticas lipogénicas y la − -glucosidasa intestinal [4], la d-allulosa es apenas metabolizy absorabsoren el intestino delgado [5], lo que puede reducir aún más la hiperglucemia postprandial, mejorar la resistencia a la insulina y reducir la acumulación de grasa corporal, que es de gran beneficio tanapara la obesidad y la diabetes [6~7]. Además, la d-allulosa ha sido declarada "generalmente reconocida como segura" (GRAS) por la administración de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos (FDA) [8] y puede usarse en alimentos y medicamentos.

La D allulosa es un nuevo monosacárido raro que es seguro para la salud. Tiene propiedades fisiológicas tales como la reducción de la respuesta de glucosa en sangre, la reducción de la producción de grasa hepática, el mantenimiento del peso corporal, anti-oxidy la protección de los vasos sanguíneos. La d-allulosa es cada vez más valorada por los investigadores por sus especiales funciones nutricionales y biológicas. Puesto que el contenido ded-allulosaenNature (en inglés)Es muy bajo, es difícil prepararlo por los métodos químicos. En la actualidad, el principal método de producción es la isomerienantioselectiva entre d-fructosa y D-allulose[9~10]. La cetosa 3-isomerasa involucrada es un punto caliente de investigación, que se puede obtener a partir de diferentes microorganismos. La más comúnmente utilizada es la d-allulosa 3-isomerasa de Agrobacterium tumefaciens[11~12] .

1 Investigación y desarrollo tecnológico

1. 1 Método de síntesis química

Al principio,La d-allulosa fue sintetizpor métodos químicos. Bilik et al. [13] encontraron que en una solución acuosa ácida, la d-fructosa se puede convertir en D-allulose bajo la acción catalítica de iones molibdato.

En 1997, Donald [14] preparó d-allulosa sintetizquímicamente 1,2:4,5-di-o-isopropildeno - → -d-fructopiranosa. Además, el ácido d-alo-cetónico también puede ser sintetizhiretanol y trietilamina [15]. Con la profundización de la investigación, el método de síntesis química tiene las desventajas de alto costo, operación peligrosa, proceso difícil, purificación compleja, bajo rendimiento, fácil de causar contaminación ambiental, y su seguridad del producto debe ser estudiado. Gradualmente está siendo reemplazado por el método de bioconversión.

1. 2   Método de bioconversión

La bioconversión de d-allulosa fue propuesta por primera vez por el profesor Ken Izumori de la universidad de Kagawa en Japón. Utiliza hexitol como intermediario para completar la bioconversión entre raras hexosis, es decir, el método de bioconversión de Izumoring [16]. Involucra una diastereoisomerasa (específica para la diastereoisomeride grupos hidroxilo), una poliol deshidrogenasa (catalizando la reacción entre la cetosa y el alcohol de azúcar) y una aldopentosa isomerasa (reacción de isomeride aldopentosa) [17]. Entre ellos, la d-allulosa 3-epimerasa (DPE) puede convertir d-fructosa y d-allulosa.

1. 2. 1 D-Allulose 3-epimerase

La d-allulosa 3-epimerasa es la enzima clave para la conversión de d-fructosa a d-allulosa y es un miembro de la familia de enzimas cetosa 3-epimerasa. En 1993, Izumori et al. [16] aislaron y puripor primera vez una cetosa isomerasa de Pseudomonas cichorii. Su producto óptimo es la d-tagatosa, por lo que fue nombrada D-tagatose 3-epimerasa (DTE). DTE). Además, Kim et al. [18] descubrieron una enzima en Agrobacterium tumefaciensSTR. C58 que cataliza específicamente la conversión de d-fructosa a d-allulosa con una tasa de conversión de 32,9%. Fue nombrado D- allulose 3-epimerase. En los últimos años, las d-allulosa 3-epimerasas de diferentes fuentes microbihan sido gradualmente descubiertas (ver tabla 1), y sus propiedades han sido estudiadas.

1. 2. 2 propiedades de la D-allulose 3-epimerasa

Las propiedades de la d-allulosa 3-epimerasa varían dependiendo de la fuente microbiana. Como puede verse en la tabla 1, la temperatura óptima para la mayoría de las d-allulosa 3-epimerasas es de 50-70°C, y el pH óptimo es de 7.0-8.0. El pH óptimo para la D-tagatose 3-epimerasa de Rhodobacteraceae es 9.0, mientras que el pH óptimo para la D-allulose 3-epimerasa del género Doria es isomerasa tiene un pH óptimo de 6.0. Además, la actividad de la enzima se puede aumentar eficazmente mediante la adición de iones metálicos [27], y el ion metálico óptimo para la d-allulosa 3-epimerasa es Mn2+ o Co2+.

(1) efecto de la temperatura sobre la d-allulosa 3-epimerasa

La estabilidad térmica es importante para la producción industrial de d-allulosa. En términos generales, en la producción de la industria azucare, las altas temperaturas adecuadas pueden mejorar la tasa de utilización de las materias primas y la tasa de bioconversión, reducir la viscode la solución, aumentar la solubilidad de los reactivos y productos, y aumentar aún más el rendimiento [28]. Senembargo, la estabilidad térmica de la d-allulosa 3-epimerasa es pobre, y su vida Medios de comunicaciónes corta [29], lo que restringe la producción industrial. Por lo tanto, es necesario mejorar la estabilidad térmica de la D-allulose 3-epimerasa para la producción industrial de allulosa. Entre ellos, la mutagenesis aleatoria y el diseño racional de proteínas son métodos típicos para mejorar la estabilidad térmica de las enzimas en el campo de la ingeniería de proteínas [30-32].

Choi et al. [19] usaron la reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores (RPC propropensa a errores) y la mutagenesis dirigida al sitio para obtener cepas mutantes S213C, I33L y I33LS213C de D-allulose 3-epimerasa de Agrobacterium tumefaciens. En comparación con la D-allulose 3-epimerasa de tipo natural, la temperatura óptima para la actividad enzimde las cepas mutantes S213C, I33L y I33LS213C aumentó en 2,5 °C, 5 °C y 7,5 °C, respectivamente, y la vida media a 50 °C aumentó en 3,3, 7,2 y 29. 9 veces, y la temperatura de fusión aparente aumentó en 3. 1℃, 4. 3℃ y 7. 6℃. Los resultados mostraron que la estabilidad térmica de las cepas mutantes de D-allulose 3-epimerasa se mejoró significativamente, entre las cuales la cepa mutante I33LS213C puede tener el potencial de producir d-allulosa.

Mientras tanto, Zhang et al. [33] obtuvieron el mutante Y68I y el mug109p por mutagenesis dirigida al sitio en tirosina 68 y glicina 109 de la d-allulosa 3-epimerasa de bacibacibacibacibacibacibacibacibacibacibacibacibacibacibacibacisubtilis, respectivamente. Comparado con la D-allulose 3-epimerasa de tipo natural, el mutante Y68I mostró la mayor afinidad de Unión al sustry eficiencia catalítica, mientras que el mutante G109P mostró la mayor estabilidad térmica. Además, un mutante de doble sitio Y68I/G109P también se generó y mostró buenas propiedades enzim, como lo demuestran: un aumento de 17,9% en la constante de Michaelis (Km), un aumento de 1,2 veces en la eficiencia catalítica (Kcat/Km), y un aumento en la vida media a 55°C de 156 min a 260 min, y la temperatura de fusión aparente aumentó en 2,4 °C. Esto indica que el mutante Y68I/G109P es adecuado para la producción industrial de d-allulosa.

(2) efecto del pH sobre la d-allulosa 3-epimerasa

El valor óptimo de pH de la d-allulosa 3-epimerasa es 7.0-9.0, que está en el rango alcalino. Sin embargo, la producción en la industria azucarese lleva a cabo en condiciones ácidas, ya que las condiciones ácidas pueden reducir la formación de subproductos y la reacción de Browning [34-35]. Por lo tanto, el pH de reacción de la D-allulose 3-epimerasa no es ideal para las necesidades de bioconversión de la industria de monosacáridos. El pH óptimo de reacción de la enzima debe mejorarse mediante ingeniería genética para obtener un mejor producto.

(3) el efecto de los iones metálicos sobre la d-allulosa 3-epimerasa

Los iones metálicos tienen un cierto efecto sobre la D-allulose 3-epimerasa. Como puede verse en la tabla 1, el ion metálico óptimo para la D-allulose 3-epimerasa de Clostridium botulinum, D-allulose 3-epimerasa de Clostridium cellulovorans, D-allulose 3-epimerasa de Clostridium butyricum, D-allulose 3-epimerasa de Doria Formosa, y D-allulose 3-epimerasa de Clostridium tricornutum es Co2+. isomerase's el ion metálico óptimo es Co2+. El ion metálico óptimo para la D-allulose 3-epimerasa de Agrobacterium tumefaciens, la D-tagatose 3-epimerasa de Pseudomonas cepacia ST-24, la D-tagatose 3-epimerasa de Sphingobium Sp.y la D-allulose 3-epimerasa de Streptococcus rumiantium es Mn2+.

Para la d-tagatosa-3-deshidrogenasa de Burkholderia cepacia, Itoh etal. [17] mostró que la actividad no requiere la asistencia de iones metálicos, pero la adición de iones metálicos, especialmente Mn2+, aumenta significativamente la actividad. En particular, la Clostridium d-allo-hexosa 3-epimerasa tiene una estricta dependencia de iones metálicos, requiiones metálicos como cofactores para mostrar actividad. En ausencia de iones, es casi inactivo, y muestra máxima actividad en presencia de Co2+ [36]. Además, se encontró que la celulasa d-allululosa 3-epimerasa tiene una estabilidad térmica extremadamente alta en presencia de Co2+ [36].

Patel etal. [37] usaron la proteína homóde la levadura Smt3 para la fusión N-terminal para obtener Smt3 D-allulose-3 isomerasa, y bajo las condiciones óptimas de reacción, investigaron la actividad catalítica de iones metálicos divalen Smt3 D-allulose-3 isomerasa. Los resultados mostraron que la actividad de la enzima casi se pierde en presencia de Zn2+, Cu2+ y Ni2+. Ca2+ tuvo un efecto inhibitsignificativo sobre su actividad, mientras que Mg2+, Fe2+ y Ba2+ no cambiaron la actividad. Por el contrario, Mn2+ y Co2+ podrían aumentar significativamente la actividad de la enzima, incluso si la cantidad de Mn2+ en la reacción del ensayo (0.025-0.1 mmol/L) es muy baja. Jia etal. [24] estudiaron los efectos de los iones metálicos en la 3-epimerasa de Clostridium botulinum d-alto-ceto-glucosa. Los resultados mostraron que EDTuninhicompletamente la actividad de la d-alo-ceto-glucosa 3-epimerasa, y Zn2+, Mg2+, y Cu2+ inhiparte de la actividad de la enzima. Por el contrario, el Co2+ y Mn2+ aumentaron significativamente la actividad de la enzima, especialmente el Co2+ puede mejorar en gran medida la actividad de la D-allulose 3-epimerasa.

(4) influencia de otros factores sobre la d-allulosa 3-epimerasa

A excepción de la d-tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas citrea ST-24 y la d-tagatosa-3-epimerasa de Sphingobium Sp.que tienen d-tagatosa y d-fructosa como sus productos ópti, respectivamente, la mayoría de las otras 3-epimerasas de alulosa tienen d-allulosa como su producto óptimo. La tasa de conversión de equilibrio entre d-allulosa y d-fructosa está entre 28% y 33% [38].

Además, Kim et al. [39] mostraron que la d-allulosa tiene una alta capacidad de complejación con borato, lo que ayuda a la d-fructosa a producir más d-allulosa. Lim et al. [40] utilizaron la d-allulosa 3-epimerasa inmovilizcomo materia prima para producir d-allulosa de manera estable y alta en presencia de borato. Allulose. El mecanismo principal puede ser que el borato reacciona con el carbohidrato para formar un complejo, y el complejo interactúa con el sistema de la enzima para cambiar el equilibrio de cualquier reacción que implica los hidratos de carbono cis-diol a través de la diferencia en la afinidad de Unión del azúcar, logrando así una alta tasa de conversión [41~42].

2 conclusión

En la actualidad, la principal enzima industrial utilizada para producir d-allulosa es la d-allulosa 3-epimerasa, que tiene una alta afiny tasa de conversión para el sustrd-fructosa. Con el fin de aumentar aún más el rendimiento de la d-allulosa, algunos investigadores han utilizado técnicas de ingeniería genética para obtener d-allulosa 3-epimerasa con una tasa de conversión más alta. Por lo tanto, la seguridad de la expresión y secreción de enzimas en los huéspedes microbidebe estudiarse más a profundidad para evitar posibles problemas de inocuidad de los alimentos. Con la mejora de las personas#39), así como la profundización de la investigación experimental, la d-ululosa tendrá perspectivas de desarrollo más amplias.

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