¿Qué es la papaína y sus usos en la industria de piensos?

Las enzimas de papaína se encuentran principalmente en las raíces, tal, hojas y frutos de papaya, con las concentraciones más altas en el látex de frutas inmaduras (Ye Qiteng etal., 1999; Zhao Yuanfan etal., 1999; Yi Yin et al., 2000). Debido a su fuerte capacidad degradante de proteínas y la capacidad de hidrolizar enlaces amida y enlaces éster, las enzimas de papaína son ampliamente utilizadas en la industria farmacéutica, alimentaria, textil, cuero, piensos y tintes (Wu Xianrong et al., 1988).

1 Overview dePapain enzyme (en inglés)

La papaína derivada del jugo de papayano es una enzima pura. Estas enzimas crudas contienen no solo papaína sino también lisozima, cisteína proteasa, celulasa, glucanasa, glutamina y compuestos tiol de bajo peso molecular. Basándose en sus puntos isoeléctricos, las enzimas que contienen cisteína en el látex de papaya se pueden clasificar en tres categorías principales: papaína, el complejo complejo de papaína (quimopapaína), y lisozima. La papaína tiene un pIde 9.55, la quimopapaína tiene un pI de 10.10, y la lisozima tiene un pI > 11.0. Bajo condiciones casi neutr, estas tres enzimas pueden ser fácilmente separadas por cromatode columna de intercambio catiónico. En el látex de papaya, la papaína representa aproximadamente el 10% de las proteínas solubles, la quitopapaína representa el 45%, y la lisozima representa el 20% (Ling Xinghan et al., 1998).

2 estructura de papaína

2.1 papaína

La papaína fue la primera enzima descubierta, estudiada y ampliamente aplicada. En 1937, Balls y Lineweaver extrajeron papaína cristalina del jugo de papaya fresco usando un método de precipitación de sal graduada. En 1970 se determinó la secuencia de papaína, y en 1971 se determinó su estructura terciutilizando cristalografía de rayos x.

La papaína tiene una masa molecular relativa de 21.000 y consiste en una sola cadena polipeptídica compuesta por 212 residuos de aminoácidos. En 1969, Husain y Towe reportaron la secuencia de aminoácidos de esta enzima (ver figura 1).

La papaína contiene siete residuos de cisteína, seis de los cuales forman enlaces disulfurdentro de tres cadenas, mientras que el residuo de cisteína libre restante es uno de los residuos de aminoácidos esenciales del centro activo. Drenth et Al.determinaron la estructura tercide la molécula de papaína, que es de forma elípy consta de dos dominios, con una estrecha ranura en la Unión, donde se encuentra el sitio activo de la enzima (Chen Zizhen, 1978).

2.2 Curd Papain

La papaína fue descubierta, extray nombrada por primera vez por Jansen y Balls en 1941 (Jansen et al., 1941). La composición de la papaína es relativamente compleja. En 1967, Kunimitsuet al. separaron la papaína usando columnas de intercambio iónico y la clasificaron en dos tipos basados en el orden de elución: papaína uny B; En 1982, Brocklehurst et al. informaron que la papaína consiste de cuatro componentes. En 1985, utilizaron una eludel gradiente de NaCl extremadamente lenta para obtener cinco picos activos (Kunimitsu et al., 1985; Brocklehurst et al., 1987).

Silvia et al. (1989) realizaron análisis dicromáticos circulares en los cuatro subtipos de papaína. Actualmente, se ha descubierto que la papaína existe en diferentes subtipos, con sólo una o dos diferencias de aminoácidos entre ellos (Los demáset al., 1984). Según datos de bases de datos como EMBL/GenBank/DDJB, hay al menos nueve subtipos, cada uno codificado por diferentes genes. Entre estos, seis subtipos consisten en cadenas polipeptídicas con 218 aminoácidos, dos con 227 aminoácidos, y uno con 226aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de los nueve subtipos se muestran en la figura 2. Los resultados de la comparación indican que entre estos 9 subtipos, solo el subtipo II, el subtipo III y el subtipo V tienen residuos individuales de aminoácidos en sitios específicos que difieren de los de otros subtipos.

Maes et al. (1996) y Azarkan et al. (1996) determinaron la estructura tridimensional de la papaína (ver figura 3). Como se muestra en la figura 3, el plegde polipéptido de la papaína forma dos dominios de igual tamaño pero diferentes formas - el dominio L y el dominio R. El dominio L está compuesto principalmente por hé−, mientras que el dominio R está compuesto principalmente por láminas anti-paralelas −. El sitio activo se encuentra en la interfaz entre estos dos dominios. La papaína pertenece a la clase α+β, donde el dominio C-terminal de la papaína es una estructura completamente héx, mientras que el dominio N-terminal es una estructura completamente héx (Schulz et al., 1979). En contraste, la papaína pertenece a la clase α/β, con su estructura secundaria que contiene más héy hojas, y los patrones de plegde las estructuras secundarias también son diferentes (Ssolis-Mendiola et al., 1992).

La papaína contiene ocho residuos de cisteína, seis de los cuales forman enlaces disulfurintra-moleculares, mientras que los dos grupos sulfhidrilo libres activos restantes se encuentran en los residuos 25 y 117. Debido a su distancia significativa y diferentes regiones, estos dos residuos no pueden formar enlaces disulfurintra-moleculares. Los dos residuos tienen actividad similar. A partir del modelo tridimensional de la papaína, Cys117 se encuentra en la superficie molecular, por lo que es fácilmente accesible a los reactivos de derivatización y susceptible a la oxidcompleta e irreversible. El Cys25 catalítico, junto con el Cys22 y el Cys56 conservados, forman el micrositio S1. Debido al "bolsillo" relativamente grande del micro-sitio S1, casi no tiene efecto sobre la enzima#39;s especificidad del sustr. Sin embargo, el micrositio S2, compuesto de residuos en las posiciones 67, 68, 69, 133, 157 y 207, influye en la enzima#39;s especificidad del sustr(Maes et al., 1996).

2.3 Papaya lysozyme

En 1955, Smith et al. aislaron la papaína pura cristalina del látex de papaya. Más tarde, Haward y glazdeterminaron la estructura y propiedades de esta enzima. La papaína tiene un peso molecular de 24.000, que es más alto que el de la lisozima animal. Se compone de 223 aminoácidos, con la composición de aminoácidos que se muestra en la tabla 1. En comparación con la lisozima animal, la papaína tiene niveles significativamente más altos de prolina, tirosina y fenilalanina.

La disposición de los aminoácidos en el extremo N-terminal es: glicina-isoleucin-serinisoleucina. El arreglo de los aminoácidos en el extremo C-terminal es: serina-fenilalanina-glicina. La mayor estructura de la papaína fue determinada por espectroscopia de dicroísmo circular, con hésimples que representan aproximadamente el 30% del total. Las medidas espectroscópicas y las reacciones reactivas químicas indican que los residuos de triptófestán completamente incrustdentro de la molécula de la enzima y no participan en la Unión de n-acetilglucosamina o reacciones activas. La lisozima de papaína contiene 8 residuos de cisteína, 4 de los cuales forman enlaces disulfur, y 4 son grupos libres de SH. Un grupo de SH es esencial para la enzyme's sitio activo. La estructura del sitio activo de la papaína lisozima es significativamente diferente de la de la clara de huevo y la lisozima humana (Funatsu et al., 1982).

3 propiedades de la papaína

3.1 propiedades de la papaína y papaína proteasa

La similitud estructural de las proteasas de papaína determina su similitud significativa en propiedades. Tanto la papaína como la papaína proteasa exhiuna amplia especificidad de sustrato, la mayoría de los enlaces peptídicos pueden ser hidrolizados hasta cierto punto por la papaína, pero las tasas de hidrólivarían mucho entre los diferentes enlaces peptídicos, con algunos que difieren en tres órdenes de magnitud; Muchos derivados de aminoácidos y péptidos pueden servir como sustr, entre los cuales los derivados de arginson particularmente sensibles a la hidróli. Sin embargo, la papaína rompe varios enlaces mucho más rápido que la papaína.

Jansen et al. (1941) informaron que la papaína caseína proteasa hidroliza la caseína a sólo la mitad de la tasa de papaína. Ebara y Yasunobue utilizaron papaína caseína proteasa para hidrolizar la cadena β de la insulina oxidada (oxicon permanganato de potasio), destacando la enzima#39;s ventaja en enlaces peptídicos hidrolizantes que contienen residuos de aminoácidos ácidos y residuos de aminoácidos aromáticos. Al estudiar las cadenas A y B de la insulina y varios segmentos peptídicos de diferentes longitudes que contienen ácido glutámico, Layle también notó la ventaja de la papaína en enlaces peptídicos hidrolizados que contienen ácido glutámico. Vale la pena señalar que la papaína exhibe una especificidad de sustrmás amplia en medios de solvente orgánico en comparación con medios acuosos (Jin-Eon So et al., 2000).

La papaína y la chymopapaína también pueden hidrolizar enlaces amida y enlaces éster (Ling Xinghan et al., 1998). Pueden catalizar la síntesis de oligopéptidos pero producen múltiples subproductos, lo que puede ser debido a la amplia especificidad de sustrde la enzima#39;s S1 site (Jin-Eon So et al., 2000).

Los valores óptide pH de papaína y papaína proteasa varían dependiendo del sustr. La papaína proteasa, usando caseína como sustr, tiene una temperatura de reacción óptima de 80°C (pH 7.0) y un rango de pH óptimo de 3-5 a 37°C. El valor de la constante de Michaelis (Km) es 1.25 g/l (a pH 7.0 y una temperatura de reacción de 37°C) (Zucker et al., 1985). El valor óptimo de pH para la papaína es 7.0, con una estabilidad de pH que varía de 4 a 9. La actividad enzimpermanece estable por debajo de 60°C y conserva cierta actividad hasta 90°C. Debido a su alta estabilidad térmica y buena estabilidad, es adecuado para el procesamiento de piensos.

PCMD,ácido clorobencílico mercuric, ácido acético yoduro, ácido acético yoduro, peróxido de hidrógeno, NEM, y metales pesados como Hg²⁺, Ag⁺, Cu²⁺, y Zn²⁺ pueden inhibir irreversiblemente la actividad de la enzima. La papaína, que contiene dos grupos sulfhidrilo libres, es más susceptible a la oxidpor agentes oxidantes o la Unión con iones de metales pesados, lo que lleva a la inactivación. Sin embargo, en presencia de diversos agentes reductores (cisteína, ácido tioglicólico, glutatión, TDT,etc.) y algunos agentes quelmetálicos (EDTA), pueden reducir los residuos de cisteína en el centro activo, activando así la actividad enzim(Deng Jing etal., 2004).

3.2 propiedades de la papaína lisozima

La lisozima es una enzima que puede escindiel enlace − 1,4 entre n-acetilglucosamina y n-acetilglucosamina. La lisozima de papaína es una proteína alcalina con un punto isoeléctrico de 10,5, exhibisólo un tercio de la actividad de la lisozima de clara de huevo contra Listeria monocytogenes, con un pH óptimo de 4,5 y una fuerza iónica óptima de 0,04-0,07. Cuando se descomponen las paredes celulares, se comporta de manera similar a la lisozamina derivada de animales, que genera ácido n-acetilmurámico en el extremo reduc. La papaína exhibe una alta actividad en la descomposición de quitina. Por ejemplo, su actividad en la descomposición de la quitina gelatinosa es 10 veces mayor que la de la lisozima de clara de huevo, y su actividad en la descomposición (n-acetilglucosamina) − es 200 veces mayor que la de la lisozima de clara de huevo. Los productos del enzyme's degradación de (n-acetilglucosamina) - son (n-acetilglucosamina) - y (n-acetilglucosamina) -. N-acetilglucosamina no existe en un estado libre, y las reacciones de transferencia de azúcar son raramente observadas (So et al., 2000).

4 determinación de la actividad enzimática

4.1 determinación de la actividad de la papaína

La actividad de la papaína se determina midiendo la enzima#39;s capacidad de catalizar la hidrólisis de las proteínas de sustrbajo condiciones específicas (como una cierta temperatura y valor de pH), con la cantidad de aminoácidos producidos a partir de la hidrólide de las proteínas que actúa como la unidad de actividad enzim. Cuanto mayor es la cantidad de aminoácidos producidos bajo las mismas condiciones, mayor es la enzima#39;s capacidad de reacción catalítica y mayor es la actividad enzimática.

Hay tres métodos para determinar la actividad de la papaína: el método espectrofotométrico UV usando caseína como sustr, el método colorindofenol, y el método BAEE (benzoil-l-arginetil éster). Cada método tiene sus propias características. El método espectrofotométrico UV que utiliza caseína como sustres sencillo de operar, de bajo costo y adecuado para comparar la actividad enzimdurante la purificación enzim, así como para determinar la actividad de los productos de papaína y enzimas alimentarias. Aunque el método colorindofenol es difícil de realizar, requiere un equipo simple, por lo que es utilizable en áreas con recursos limitados; El método BAEE es estable y reproducible, por lo que es adecuado para estudios teóricos de las propiedades enzimáticas y la determinación de la actividad enzimen enzimas reactivas (Wu Xianrong, 2005). El método especificado en la farmacopea de los Estados Unidos y las normas farmacéuticas chinas para determinar la actividad de la papaína es el método espectrofotométrico ultravioleta que utiliza caseína como sustr(Luo Yanshou, 2000; Chen Deming et al., 2004).

Cuando se utiliza el método espectrofotométrico UV para detectar la actividad enzim, la unidad de actividad se define como: bajo las condiciones de prueba, la cantidad de enzima necesaria para liberar la cantidad de sustancia soluble en ácido tricloroacético de la caseína hidrolizada por minuto, cuando la absorbancia en una longitud de onda de 275 nm es equivalente a la absorbancia de 1 − g/ml de tirosina, es una unidad de actividad enzim.

Varias cuestiones requieren atención cuando se utiliza este método: − diferentes concentraciones de ácido tricloroacético producen diferentes resultados de actividad enzim. − la caseína de diferentes orígenes presenta diferencias significativas en la actividad de la papaína; La caseína importada tiene mejor solubilidad y mayor actividad enzim. La determinación debe realizarse bajo condiciones óptimas de pH (Zhao Yuanfan et al., 1999).

4.2 determinación de la actividad de la proteasa coagulante de la papaína

El método para determinar la actividad hidrolítica de la papaína coagulante proteasa utiliza un método espectrofotométrico UV con caseína como sustr. Esta enzima también posee actividad coagulante en comparación con la papaína, la unidad de actividad de coagse define como la cantidad de enzima necesaria para coagular 1 ml de leche descreal 10% (que contiene 0,01 mol/l CaCl₂) en 40 minutos, que se define como una unidad de actividad enzim, es decir, una unidad de Soxhlet (SU). La actividad relativa (RU) se utiliza para indicar la influencia de varios factores (Arima et al., 1967).

4.3  Determinación de la actividad de papaína lisozima

Normalmente hay tres métodos para determinar la actividad de la lisozima.

Usando la pared celular como sustr, la actividad enzimes indicada por el cambio en la turbidez antes y después de la acción.

Utilizando el medio de cultivo de Listeria monocytogenes como sustr, la actividad enzimse indica por el cambio en la turbidez antes y después de la acción.

Dado que los dos métodos anteriores implican reacciones en fase sólido líquido, es difícil medir con precisión las velocidades de reacción. Por lo tanto, algunos investigadores han preparado un sustrhomogéneo utilizando el polisacárido hexano diol quitina soluble en agua para determinar la actividad enzim.

Método espectrofotométrico: a 450 nm, disolver una cierta cantidad de polvo bacteriano liofilizado o suspensión de bacterias solubulicas descongelen en un cierto volumen de solución tamponde fosfato para lograr un valor de absorbancia de aproximadamente 1,3. Esta solución de sustry la solución enzimestándar son incubadas a 25°C en un baño de agua. Coloque 2,5 ml de sustren una cubeta de 1 cm en el baño de agua, agregue 0,5 ml de solución enzimática, inicie el tiempo, registrla lectura E1 a 1 minuto y la lectura E2 a 2 minutos y calcule la actividad enzimutilizando la fórmula. Diferentes soluciones enzimestándar con diferentes actividades enzimcorresponden a diferentes valores − E, y la actividad enzimde la enzima estándar utilizada se puede calcular sobre la base de estos valores − E, verificando así la precisión de la detección (Zhang Yong, 2004).

5 inmovilización de papaína

Las enzimas inmovilizadas son una nueva tecnología desarrollada en la década de 1960. La inmovilización se refiere al proceso de combinar células o enzimas libres con un portador sólido insoluble usando métodos físicos o químicos para mantener su actividad y permitir su uso repetido. Para mejorar la eficiencia de la utilización de la papaína y reducir los costos de producción, investigadores de todo el mundo han realizado extensos estudios sobre la inmovilización y aplicación de la papaína.

En 1961, J.Cebray logró inmovilizar la papaína en un portador de poliaminoácido y la usó para hidrolizar fragmentos de − -globulina. En 1977, J.W. Finley de los Estados Unidos empleun método de reticulde glutaraldehído para inmovilizar la papaína en la quitina, y lo utilizó en el proceso de producción de cerveza, logrando buenos efectos de clarificación. En 1978, P. Monsan et al. en Francia usaron vidrio microporoso aminoalquilado como un portador para cruzar la papaína en su superficie, y también lo aplica la claride cerveza (Ling Xinghan et al., 1998).

Xu Fengcai et al. (1992) utilizaron la celuldel bagde de caña de azúcar y el nailon como portadores para inmovilizar la papaína, determinaron las propiedades enzimde la enzima inmovilizy la aplicaron a la claride la cerveza. Li Hong et al. (2001) usaron microesferas de quitosana para inmovilizar la papaína, estudiaron las propiedades enzimde la enzima inmoviliz, y la aplicaron a la hidrólide caseína para la producción de tirosina. Los autores también han llevado a cabo una serie de estudios en esta área, incluyendo la inmovilización de papaína usando fibras de seda de gusanos de seda, han investigado las propiedades enzimde la enzima inmovilizy la han aplicado a la hidrólisis de caseína para la producción de tirosina, así como la papaína inmovilizde seda en un reactor de lecho bloqueado y su aplicación, todos los cuales han dado resultados satisfactorios (Chen Fangyan et al., 2004, 2005a, 2005b), y han obtenido los correspondientes productos de papaína inmoviliz.

6  Aplicación de papaína en la industria de piensos

Durante el procesamiento de alimentos, se generan grandes cantidades de subproductos proteicos, como plumas de animales, sangre de animales después del sacrificio, adornos de peces y cabezas de peces a partir del procesamiento de pescado. Estas proteínas, cuando se muelen directamente en el alimento, son difíciles de digerir y absorber para los animales. Su descarte no sólo desperdirecursos sino que también contamina el medio ambiente. Mediante el uso de proteasas para hidrolizar estas proteínas en proteínas solubles de moléculas pequeñas y aminoácidos, se vuelven fácilmente digeribles y absorbibles por los animales. Esto no sólo permite el desarrollo de piensos proteicos de bajo costo y alta calidad, sino que también mejora la eficiencia en la utilización del pienso y reduce los costes de alimentación (Lu Shimin et al., 2001; Tan Aijuan et al., 1998; Yang Ping et al., 2008). Actualmente, las enzimas de proteínas animales son demasiado caras para la hidrólisis; Los métodos de fermentación microbiana son propensos a la contaminación por Otras bacterias y puede contener toxinas; Sin embargo, la papaína tiene una fuerte actividad, alta estabilidad térmica y buena estabilidad, por lo que es adecuada para el procesamiento de alimento.

Además, la papaína, cuando se añade como aditivo alimentario a las dietas de ganado, ayuda en la digestión del alimento, mejora la eficiencia del alimento, reduce la ingesta de alimento, mejora las tasas de crecimiento en el ganado y tiene efectos significativos en la producción de leche, la calidad de la leche y la prevención de la mastitis en vacas lecheras.

Zhang Qing et al. (1996) añadió 0,3% de papaína a la alimentación de camarones y estudió los cambios en la actividad de la papaína durante la producción y sus efectos en la acuicultura. Encontraron que bajo condiciones de producción de alimento para camarón (85°C, 45 minutos), la pérdida de actividad de papaína era severa. Sin embargo, bajo condiciones de producción de alimento para aves de corral (temperatura 75°C), la actividad de la proteasa se conservbastante bien. Por lo tanto, bajo condiciones de pelletización, la temperatura a la cual la mayor parte de la actividad enzimpuede ser preservada es alrededor de 75°C. En la cría de camarones, demostró un cierto efecto de promoción del crecimiento, aumentando el rendimiento en un 5%.

Binshiyu et al. (1996) añadieron 0,1% de papaína a la dieta de cerdos en crecimiento, lo que mejoró el aumento de peso diario y la tasa de conversión alimentaria, con el efecto más significativo observado en cerdos de 10 a 20 kg de peso (P < 0.01). Los resultados indican que la adición de papaína a la dieta de cerdos en crecimiento durante la fase inicial de crecimiento es más apropiada, y también puede usarse en cantidades moderadas durante la fase media de crecimiento.

He Ting et al. (1992) alimentó a pollitos tipo carne con una dieta suplementada con papaína (40.000 unidades /kg de alimento). Los resultados mostraron que aunque no hubo diferencia significativa en el aumento de peso promedio entre los grupos suplementados con papaína (P > 0.05), el consumo de alimento fue ligeramente menor en todos los grupos experimentales en comparación con el grupo control. Además, el uso de alimento de proteína FS (harina de sangre fermentada) en la dieta fue más eficaz que la harina de pescado. La razón puede ser que el alimento con proteínas FS no solo contiene sangre animal, sino también varios portadores de harina y tortas ricos en fibra vegetal, lo que puede permitir que otras enzimas en la papaína ejerzan sus efectos.

7 conclusión

La papaína es un producto puro natural con fuertes capacidades de hidróliproteolíy síntesis, así como coagulación, lipóli, y actividad bacteriolí, por lo que es altamente versátil. Actualmente, la proporción global de aplicación de papaína es la siguiente: 75% en la industria cervecera y de bebidas, 10% en la industria de procesamiento de carne, 5% en la industria de procesamiento de pescado, 3% en la industria farmacéutica, 5% en la industria de procesamiento de alimentos, y 2% en otros campos. Es evidente que la proporción de aplicación de papaína en la industria de piensos es relativamente baja, lo que indica un potencial significativo para un mayor desarrollo. Las razones pueden incluir: el costo relativamente alto de la enzima durante el procesamiento del alimento, pérdida significativa de la actividad enzim, lo que limita su aplicación; O, como aditivo alimentario, la enzima no se utiliza científicamente durante el proceso de alimentación. Por lo tanto, cómo mejorar y mantener de manera más eficaz y sostenible la actividad de la papaína; Y cómo usar correcta y razonablemente esta enzima en diferentes especies animales y en diferentes etapas de alimentación para maximizar su eficacia son áreas clave que merecen futuros esfuerzos de investigación y desarrollo.

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