¿Cómo inmovilizar polvo de papaína?

La papaína [EC 3.4.22.2] es un importante producto bioquímico con amplias aplicaciones en las industrias alimentaria y farmacéutica, así como en el procesamiento de piensos, textiles y cuero [1]. Debido al alto costo de la papaína y su incapacidad para ser reutilizada, los investigadores han estado explorando la preparación de la papaína inmoviliz. Esta investigación comenzó a principios de la década de 1960 y desde entonces ha sido ampliamente documentada en la literatura [2]. Los principales métodos para la inmovilización enzimincluyen incrust, adsor, enlace covalente y reticul, cada uno con sus propias ventajas y desventajas [3]. Este documento resume la investigación reciente y el progreso de la aplicación de la papaína inmoviliz, compara las características enzimtales como la actividad enzim, la estabilidad y la tasa de recuperación de la papaína inmovilizpreparada usando varios métodos de inmovilización en los últimos años, y proporciona sugerencias.

1 método de incorporación

Método de incrust: el método de incrustde enzimas o células bacterianas que contienen enzimas en un portador poroso para fijar enzimas se llama método de incrust. La incrustde Gel es un método de incrustde enzimas en la estructura microporosa de varios geles para producir enzimas inmovilizde una forma específica. Los geles más comúnmente utilizados incluyen agar, agarosa, alginato de calcio, carragenina y poliacrilamida. La incorporación de microcápsulas involucra encapsulde la enzima dentro de una membrana de polímero semipermepara producir enzimas inmovilizmicrocápsula.

1.1 papaína inmovilizada (IPSAC)

El ácido algínico se extrae de algas pardas y es un polisacárido compuesto de ácido glucurónico unido por enlaces − 1,4. Es un portador ideal para la encapsulde enzimas, con un método de inmovilización simple, condiciones suaves y operaciones que se pueden realizar a temperatura ambiente, resultando en una inactivación enzimmínima. Sin embargo, los geles de alginato de calcio son inestables en soluciones que contienen aniones polivalentes (fosfatos, cítricos, lacatos, etc.) y altas concentraciones de electrolitos (K+, Na+), con iones de Ca2+ que se desprenfácilmente, causando que el gel se ablano o incluso se disuel. He et al. [4] estudiaron la inmovilización de la papaína usando alginatoquitosano sódico en dos aspectos: en primer lugar, utilizaron una solución tampón de ácido clorclorde tris durante la preparación del gel para reducir el desprendimiento de iones Ca²⁺ y mantener la estabilidad del gel; En segundo lugar, primero agregpolvo de quitosano para mejorar la dureza del gel. Las cargas positivas (-NH -) en el quitosano interactúan con los grupos carboxilo del alginato, estabilizando el gel, haciéndolo adecuado para la carga de columnas. La actividad enzimde la enzima inmovilizera la misma que la de la enzima sin polvo de quitina.

En He et al.'s [4] estudio, el valor óptimo de pH para PA e IPSAC fue de 7.2, y la actividad se mantuvo estable a temperaturas inferiores a 70°C. La estructura espacial de la PA incrustno cambió, por lo que el valor óptimo de pH y la estabilidad térmica se mantuvieron esencialmente sin cambios. La vida media de IPSAC es de 59 días.

La papaína inmovilizde alginatoquitosano sódico (IPSAC) presenta una buena estabilidad térmica, una larga vida media y alta dureza del gel, por lo que es adecuado para la carga de columnas y conveniente para la producción automatien entornos industriales.

1.2 Chitosan capsule method for immobilizing papain (en inglés)

El quitosano es un biopolímero obtenido por deacetilde quitina, también conocido como quitina deacetilada. Como transportador enzim, el quitosano tiene ventajas tales como estabilidad química y buena estabilidad térmica, por lo que es un excelente transportador para enzimas inmoviliz.

Huang Zeyuan [5] utilizó quitosano y carboximetilcelulde sodio para formar cápsulas para la inmovilización de papaína, determinando las condiciones óptimas para la inmovilización enzimde la siguiente manera: carga enzimde 500 mg/10 mL, concentración de quitosano de 0,2%, pH de 7,5 y temperatura de 50°C. La tasa de recuperación de la actividad de la papaína inmovilizalcanzó el 69.8%.

2. Método de adsorción

Método de adsorción: el método de inmovilización de enzimas o células bacterianas que contienen enzimas adsorbiéndolas en la superficie de un adsorbente sólido se denomina método de adsorción. Los adsorbentes comunes incluyen carbón activo, óxido de aluminio, tierra diatomeas, cerámica porosa, vidrio por, gel de sílice y carboxifosfato. El método de adsorpara preparar enzimas inmovilizes simple de operar, tiene condiciones suaves, no causa desnaturalización o inactivación enzim, utiliza portadores baratos y fácilmente disponibles, y puede ser reutilizado. Sin embargo, debido a las débiles fuerzas físicas de adsor, el complejo transportador enzimes inestable y propenso a desprendimiento, limitando su aplicación práctica en la producción industrial. La investigación en esta área también es relativamente escasa.

2.1 método de adsorpor congelación y vacío para la inmovilización de papaína en materiales mesoporosos

Hay varios métodos para ensamblmateriales funcionales en los poros de las cribas moleculares mesopor, incluyendo la adsoren fase gasey la impregnación. En comparación con los métodos de adsorción convencionales, el método de adsorpor congelación y vacío es un nuevo enfoque con las siguientes ventajas: en primer lugar, proporciona una fuerte fuerza motriz, lo que resulta en una mayor adsorde proteínas; En segundo lugar, mantiene la actividad enzima a bajas temperaturas.

Gao Bo et al. [6] usaron material mesoporoso SBA-15 como transportador para preparar papaína inmoviliz. Comparando las características de las enzimas inmovilizy enzimas de solución, encontraron que la temperatura óptima para la papaína aumentó de 60°C a 70°C después de la inmovilización. El valor óptimo de pH para la enzima después de la inmovilización fue de 7.0, sin cambio en el valor óptimo de pH, lo que puede atribuirse a las propiedades de carga superficial neutra del tamimolecular mesoporsba-15. Una cierta cantidad de enzima inmovilizy solución enzimse tomaron, se incubaron A 30-90 °C durante 30 minutos, se enfrirápidamente A temperatura ambiente, y luego se midió la actividad enzima A 37°C.

Después de que la papaína fue ensamblen cribas moleculares, su estabilidad térmica fue significativamente mejorada. Incluso después de ser incubado a 90°C durante 30 minutos, retuvo el 70% de su actividad, mientras que la enzima de solución ya había perdido su actividad a 90°C. Esto indica que ensamblla enzima en cribas moleculares puede mejorar la estabilidad térmica. Debido a que las altas temperaturas no solo aumentan las tasas de reacción, reducen la contaminación bacteriana, sino que también mejoran la solubilidad del sustr, mejorando así el rendimiento, las enzimas inmovilizpreparadas usando material mesoporsba-15 como transportador exhiuna excelente estabilidad térmica, hacilas más adecuadas para aplicaciones industriales.

Los resultados experimentales indican que bajo condiciones adecuadas de vacío, el método de adsorpor congelación y vacío puede ser utilizado para preparar enzimas inmovilizcon alta eficiencia de montaje, y la actividad enzimse mantiene buena con alta estabilidad. Por lo tanto, la adsorpor congelación y vacío puede servir como un nuevo método para inmovilizar proteínas enzim.

3 método de acoplamiento covalente

Método de acoplcovalente: el método de preparación de enzimas inmovilizmediante la Unión covalente de grupos no esenciales fuera del centro activo de la enzima con grupos en el transportador de fase sólida se llama método de acoplcovalente, también conocido como método de enlace covalente. El método de Unión covalente es uno de los métodos de inmovilización más activamente investigados en la actualidad. Sus ventajas incluyen una fuerte Unión entre la enzima y el transportador, resistencia al desprendimiento, y la capacidad de ser utilizado continuamente durante períodos prolongados.

Sin embargo, también tiene los siguientes inconvenientes: (1) durante el proceso de inmovilización, ocurren colidirectas (rígidas) entre las moléculas de la enzima y las moléculas portadoras, lo que puede alterar la enzima#39;s conformación y causa inactivación; (2) los portadores son generalmente sustancias hidrofóbicas. Cuando las enzimas son directamente inmovilizadas en los portadores hidrofóbicos, la enzima#39;s microambiente se altera, lo que conduce a cambios conformacionales, pleg, o desnaturalización de la proteína de la enzima; Inactivación; (3) el método de acoplcovalente tradicional resulta en enzimas inmovilizcon baja libertad de movimiento, y hay un impedimento estérico significativo entre las moléculas de la enzima y los sustratos, lo cual es desfavorable para mantener la actividad catalítica homogénea del estado libre de la enzima. Por lo tanto, este método se conoce como "inmovilización rígida."

Los portadores comunes para el acoplcovalente incluyen celul, dextran, agarosa y quitina. Aquí, nos centramos en varios nuevos métodos de acoplamiento covalente para inmovilizar la papaína.

3.1 inmovilización Flexible de papaína usando almidón Bis-Aldose

Para abordar los problemas con los métodos de acoplamiento covalente, los investigadores propusieron unir cadenas cortas (moléculas del brazo) a la superficie portadora para lograr la "inmovilización basada en el brazo" de las enzimas. Sin embargo, dado que estas cadenas de brazo son pequeñas cadenas cortas de peso molecular y algunas son cadenas de carbono hidrofóbic, las moléculas enzimtodavía experimentan fuerzas de impacto significativas durante la inmovilización, lo que lleva a cambios conformacionales e inactivación. Wang Haiping, Wei Rongqing, et al. [7-8] propuel modelo de la "enzima inmovilizflexible", que consiste en unir cadenas moleculares hidrófilas de longitud suficiente al portador de la inmovilización, conocido como "cadenas flexibles", y luego unir la enzima a las cadenas flexibles. Se utilizaron los siguientes pasos para lograr la inmovilización flexible de la papaína, como se muestra en la figura 1.

Usando el modelo de inmovilización flexible de enzimas, un transportador flexible (quitosan-das50) fue preparado usando quitosano y almidón bis-aldehído, y la papaína fue inmovilizflexiblemente. La tasa de recuperación de la actividad de la enzima inmovilizalcanzó el 72%, que es tres veces la del brazo transportador chitosan-glutaraldehído (Chitosan-GA). La papaína flexiblemente inmovilizconservó la mitad de su actividad después de 7-8 lotes y exhibiuna estabilidad de almacenamiento significativamente mayor que la enzima libre.

Los resultados indican que el método de "inmovilización flexible" no sólo reduce la inactivación de la enzima durante el proceso de inmovilización, sino que también asegura que la enzima inmovilizconserva una mayor actividad catalítica homogénea en comparación con la enzima libre.

3.2 inmovilización de papaína en microesferas de polímero magnético

Las microesferas de polímeros magnéticos son polvos ultrafinos que contienen metales magnéticos u óxidos metálicos (tales como hierro, cobal, níquel y sus óxidos) y que exhirespuesta magnética. Son un nuevo material polimérico funcional desarrollado en las últimas dos décadas. A través de la copolimeri, modificación de la superficie, y otras reacciones químicas, varios grupos funcionales reactivos (tales como grupos hidroxilo, carboxilo, grupos aldehído, y grupos amino) a través de reacciones químicas tales como la copolimerización y modificación de la superficie. Estos grupos funcionales pueden formar enlaces covalentes con sustancias bioactivas como enzimas y anticuerpos. Bajo la influencia de un campo magnético externo, estas microesferas pueden experimentar un rápido movimiento o separación. Por lo tanto, las microesferas de polímeros magnéticos, como un nuevo tipo de material polimérico funcional, tienen amplias perspectivas de aplicación en campos como la biomedicina, la bioingeniería y la inmovilización enzim.

Zeng Lixi et al. [9] sintetizuna altamente hidrófila, de tamaño uniforme, bien disperpolímero magnético compuesto pormicroesfera con una superficie rica en grupos epoxi funcionales, que se utiliza para la inmovilización de la papaína. Utilizando caseína como sustr, se estudiaron las propiedades enzimy los parámetros cinéticos de las enzimas inmovilizadas. Los resultados mostraron que la temperatura de reacción óptima para las enzimas inmovilizadas fue de 80°C. Después de la incuba 90°C durante 40 minutos, las enzimas inmovilizretuvieron el 65% de su actividad enzimoriginal, mientras que las enzimas en solución sólo retuvieron el 6,6% de su actividad enzimoriginal. El pH óptimo de reacción fue de 7,5. Cuando el pH varió de 6.0 a 8.5, la enzima inmovilizexhibiconsistentemente mayor actividad que la enzima libre, con una tasa de recuperación de la actividad enzimde 55.2%. La enzima inmovilizdemostró una mejor tolerancia ácibase y mejoró significativamente la estabilidad térmica, la estabilidad del pH y la estabilidad operacional en comparación con la enzima libre.

Papaína inmoviliz, este portador posee excelente hidrofilicidad, biocompatibilidad, gran área de superficie, y un alto contenido de grupos epoxi funcionales, lo que permite la preparación de enzimas inmovilizaltamente activas y eficientes. Utilizando la capacidad de respuesta magnética del transportador, la enzima puede ser fácilmente separada del sistema de reacción bajo un campo magnético externo, haciendo de esto una tendencia en el uso de catalizadores para reacciones bioquímicas.

3.3 Metal quelation carrier-directed inmobiliof papain

La cromatode afinidad por quelde metales (IMAC) utiliza el enlace de coordinación entre ligandos quelde metales y aminoácidos donde electrones en la superficie de la proteína, como el grupo imidazol de histidina y el grupo tiol de cisteína (con histidina siendo el más importante), para lograr la separación y purificación de proteínas. Los portadores quelantes de metales tienen un impacto mínimo en la conformación de proteínas inmovilizen en sus superficies y pueden ser reutilizados. La aplicación de esta técnica a las enzimas inmovilizes prometepara superar algunas de las limitaciones de los portadores y métodos de inmovilización utilizados actualmente.

Liu Linlin etal. [10] utilizaron microesferas de agarose quelde metales magnéticos como portadores y explotaron la interacción entre ligandos quelde metales (IDA-Cu²⁺) y aminoácidos donde electrones en la superficie de la proteína para inmovilizar papaína direccionalmente. Las condiciones óptimas de inmovilización fueron Cu − − 1.5 − 10 − (−2) mol/g portador, tiempo de inmovilización 4 h, pH de inmovilización 7,0, y carga enzim30 mg/g portador. La temperatura óptima de reacción para la enzima inmovilizes de 70°C, y el pH óptimo de reacción es de 8.0. La estabilidad térmica de la enzima inmovilizes significativamente mayor que la de la enzima solución. La recuperación de la actividad enzimde la enzima inmovilizes del 68.4%, y presenta buena estabilidad operacional. Después de cinco usos repetidos del transportador, la actividad enzimde la enzima inmovilizes del 79,71% de la de la enzima inicialmente inmoviliz.

Los resultados indican que cuando se utilizan portadores quelantes metálicos para la inmovilización dirigida de papaína, las condiciones de reacción de inmovilización son leves, con un impacto mínimo en la enzima#39;s estructura de orden superior, y recuperación de alta actividad enzim; Mejora significativamente la estabilidad térmica de la enzima inmoviliz; El transportador tiene una alta capacidad de carga enzim; La regeneración del transportador y la inmovilización de la enzima son fáciles de operar; La enzima inmovilizy el transportador pueden ser reutilizados varias veces, y el costo de producción de la enzima inmovilizes bajo. Por lo tanto, esta tecnología tiene amplias perspectivas de aplicación en la industria.

3.4 papaína inmovilizsoluble

Las enzimas inmovilizpreparadas por métodos tradicionales tienen ventajas tales como una buena estabilidad y una recuperación conveniente, pero su aplicación es limitada cuando se trata de soluciones de sustrinsolu, de alta visco, lo que resulta en una baja eficiencia catalítica. La baja eficiencia catalítica de las enzimas se atribuye a la reacción catalizada por enzimas que ocurre en un sistema de reacción no homogéneo entre las fases sólida y líquida, lo que resulta en una probabilidad de contacto enzimsustrsignificativamente menor en comparación con los sistemas de reacción enzimlibres homogé. Por lo tanto, el enfoque de mejorar la eficiencia catalítica de las enzimas inmovilizdebe estar en la optimización del sistema de reacción catalítica y la preparación de enzimas inmovilizcapaces de formar un sistema catalítico de reacción homogéneo.

Li Lingling et al. [11] la papaína conjug(PP) con succinato de acetato de celulcarboxilmetil(As-L) para preparar PP inmovilizsoluble en agua. Se determinó que los valores óptide pH para PP inmovilizlibre e inmovilizsoluble en agua fueron 6.0 y 5.0, respectivamente, con temperaturas de reacción óptimas de 60°C y 70°C, y valores de Km de 2.53 y 3.07 mg·mL, respectivamente. El PP inmovilizsoluble conserv62% de su actividad después de 12 horas de incuba 60°C, 62% de su actividad se mantuvo; A 4°C, después de 30 días, la actividad retuvo más del 90%; A un pH de 6,0, la estabilidad era mejor, y se mantuvo relativamente estable dentro de un rango de pH de 4,0 a 7,0 (actividad relativa > 80%). PP inmovilizsoluble puede disolver completamente en soluciones con un pH mayor que 5,5, con un rango de pH óptimo más estrecho, aumento de la temperatura óptima, y un valor de Km más alto; Se mejora significativamente la estabilidad térmica y ácido-base.

La papaína inmovilizsoluble combina la alta actividad catalítica de la papaína libre con la alta estabilidad y facilidad de recuperación de enzimas insolubles inmoviliz, ofreciendo amplias perspectivas de aplicación en aplicaciones industriales.

4 método de enlace

Método de cruzamiento: el método de cruzamiento implica el uso de reactivos bifuncionales para inducir el cruzamiento entre moléculas de enzimas o entre moléculas de enzimas y portadores de fase sólida para producir enzimas inmoviliz. Los reactivos bifuncionales comúnmente utilizados incluyen glutaraldehído, hexametilenetetramina, anhídrimale, y bis(2-nitro-5-nitrofenil) amina. Entre ellos, el glutaraldehído es el más utilizado. Las enzimas inmovilizadas por el método de reticulmuestran una fuerte Unión y pueden usarse por períodos prolongados. Sin embargo, debido a la naturaleza vigorosa de la reacción de reticul, múltiples grupos de las moléculas de la enzima están reticul, lo que resulta en una pérdida significativa de la actividad de la enzima. En aplicaciones prácticas, este método se combina a menudo con otros métodos de inmovilización, tales como encapsulen gel seguido de cross-linking. Esta técnica, que emplea dos o más métodos para la inmovilización, se conoce como inmovilización dual o múltiple. Usando este método, se pueden preparar enzimas inmovilizcon alta actividad enzimy buena resistencia mecánica.

El Cross-linking es el método más comúnmente usado para inmovilizar la papaína. La investigación en esta área comenzó temprano en China [12-13], por lo que sólo vamos a enumerar algunas de las últimas aplicaciones de investigación de los métodos de reticulpara inmovilizar la papaína en nuevos materiales de transporte.

4.1 silk-inmovilizpapain

Chen Fangyan et al. [14] usaron fibroína de seda activcomo transportador y empleun método de reticulcovalente para inmovilizar la papaína, investigando las propiedades enzimde la papaína inmovilizpor fibroína de seda. Los resultados indicaron que, debido a que la fibroína de seda es un polímero hidrófilo, la papaína inmovilizpreparada usando fibrode seda como un portador exhibiuna afinsignificativamente mayor por el sustr. La constante aparente de Michaelis Km app[caseína] de la enzima inmovilizfue 0,092%, que fue 0,46 veces la de la enzima solución (figura 2); El pH óptimo fue de 7,5; A valores de pH entre 6,5 y 8,0, la actividad enzimse mantiene estable dentro de un rango de temperatura de 4,0 a 55°C; La vida media operativa de la enzima solución es de 38 días, mientras que la de la enzima inmovilizes de 54 días. La semivida operacional de la enzima inmovilizes significativamente más larga que la de la enzima solución.

4.2 papaína inmovilizusando ovalbumin como portador

Huang Yibing et al. [15] usaron ovovoalbúmina desnaturdirectamente como un portador, combinado con métodos tradicionales de inmovilización de reticul, e inmovilizexitosamente la papaína usando glutaraldehído como agente de reticul, simplificando los pasos operacionales. Los estudios han demostrado que la papaína inmovilizusando ovobumin como un portador exhibe temperaturas de reacción óptimas de 60°C para la enzima nativa y 90°C para la enzima inmovilizbajo las mismas condiciones de reacción.

Se incrementó la temperatura de reacción óptima de la enzima inmoviliz. El valor óptimo de pH de la papaína inmoviliztambién se desplazhacia la alcalinidad a 8,0, y la estabilidad ácida de la papaína inmovilizusando polvo de ovoalbúmina como un portador se mejoró significativamente. Después de ser tratada en un baño de agua hirviendo a 100°C durante 5 horas, la papaína inmovilizretuvo el 54,6% de su actividad, mientras que la enzima en solución perdió por completo su actividad enzimdespués de 2,5 horas de tratamiento. Los resultados experimentales indican que la papaína inmovilizexhibe mayor estabilidad bajo condiciones ambientales. La estabilidad es un factor crítico que determina la aplicabilidad práctica de las enzimas inmoviliz. En la mayoría de los casos, la estabilidad enzimaumenta después de la inmovilización, lo cual es altamente ventajo.

4.3 chitosan-inmovilizpapain

La papaína inmovilizcon quitosanes es actualmente un método relativamente maduro para inmovilizar la papaína [16-18]. El método principal consiste en el uso de quitosano como transportador y glutaraldehído como agente reticulpara preparar papaína inmoviliz[18]. Usando quitosano como transportador, el método para preparar la papaína inmovilizes simple, con condiciones de inmovilización suaves, y la enzima inmovilizresultante exhibe una resistencia al calor significativamente mejorada y estabilidad térmica, por lo que es un método comúnmente utilizado para inmovilizar papaína.

5 resumen y perspectivas

Existen numerosos métodos para preparar la papaína inmoviliz. A partir de estos extensos estudios, se puede observar que después de la inmovilización, las enzimas experimentan ciertos cambios en sus características debido a la influencia de los portadores y otros factores. Por lo tanto, durante la aplicación de enzimas inmoviliz, es esencial entender las diferencias en las propiedades entre las enzimas inmovilizy las enzimas libres, ya que este conocimiento es crucial para optimizar su aplicación. Al ajustar el proceso en consecuencia, las enzimas pueden ser operadas en condiciones óptimas para catalizar las reacciones de manera eficiente. Debido a las diferencias en los diseños experimentales entre los investigadores, es un reto evaluar las ventajas y desventajas de varios métodos de inmovilización. La papaína inmovilizpreparada usando diferentes métodos tiene diferentes rangde aplicación, y el método apropiado debe ser seleccionado basado en las necesidades reales para servir mejor la producción.

Después de ser inmovilizusando varios métodos, la papaína exhibe estabilidad mejorada, temperatura óptima aumentada, rango de tolerancia de pH más amplio, actividad enzimmejorada, y vida media extendida, indicando que el método de inmovilización es apropiado. Debe buscarse una mayor optimización para lograr mejores resultados. Sobre la base de los resultados de la investigación existente, mejorar aún más la actividad y afinal sustrde las enzimas inmovilizes un enfoque clave para la investigación futura.

Resumiendo los recientes avances en el estudio de la papaína inmoviliz, puede verse que con el continuo avance de la tecnología, la actividad catalítica y estabilidad de la papaína inmovilizson satisfactorias. La tecnología de inmovilización enzimpermite el uso repetido de enzimas y la separación efectiva de materias primas, productos y enzimas, simplificando así los procesos y equipos de separación, acortando los ciclos de producción y reduciendo los costos de producción. Las enzimas inmovilizadas se convertirán en una importante forma de aplicación de enzimas en la industria. La creciente madurez de la tecnología de inmovilización enzimpermitirá a la papaína desempeñar un papel aún mayor en alimentos, bebidas, productos farmacéuticos, reactivos químicos, piensos, textiles y cosméticos.

referencias

[1] Jone J G. papain refinado [J]. Process Biochemistry, 1974, 9(6): 21-24.

[2] Xiong Hua. Avance de la investigación sobre la aplicación de papaína [J]. Preservación y procesamiento, 2006(1): 7-8.

[3] Yao X L, Ku H S, Song W J. estudio de las características enzimde la tripsina inmovilizante con diferentes portadores [J]. Biotechnology, 2007, 17(3): 71-73.

[4] He Ping, Huang Zhuolie, Li Chuny, et al. Inmovilización y propiedades de papain [J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2008, 16(4): 334-338.

[5] juang Zeyuan. Estudio sobre la inmovilización de la papaína en cápsulas de quitosano [J]. Ciencia y tecnología de los alimentos, 2002(12): 10-12.

[6] Gao Bo, Zhu Guangshan, Fu Xueqi, et al. Inmovilización de papaína en materiales mesoporosos usando adsorción por congelación al vacío [J]. Journal of Jilin University, 2005, 43(6): 66-71.

[7] Wang Haiping, Wei Rongqing, Shen Bin, et al. Estudio sobre la inmovilización Flexible de papaína con almidón Bis-Aldose [J]. Bioprocess Engineering, 2004, 2(1): 25-29.

[8] Wei Rongqing, Shen Bin, Liu Xiaoning, et al. Inmovilización Flexible de papaína usando Chitosan Carrier [J]. Journal of Process Engineering, 2005, 5(2): 183-187.

[9] Zeng Lixi. Estudio sobre la actividad y estabilidad de la papaína inmovilizada en nuevas microesferas porosas de polímeros magnéticos [J]. Revista de ciencias naturales, universidad Normal de Hunan, 2007, 30(1): 101-106.

[10] Liu Linlin, Zeng Lixi, Liu Ting, et al. Estudio sobre la inmovilización dirigida de papaína en portadores quelatos metálicos [J]. Journal of Bioengineering, 2005, 20(5): 26-31.

[11] Li Lingling, Zhang Tao, Yu Rong, et al. Preparación y propiedades de la papaína inmovilizsoluble [J]. Journal of West China Pharmacy, 2007, 22(2): 77-79.

[12] Tao Guoliang, Li Yanfeng. Estudio sobre la inmovilización de papaína en clorpolivinde macroporoso esférico tratado con amonio [J]. Química aplicada, 1993, 10(2): 9-12.

[13] Tan Huiying, Chen Xuelin. Inmovilización y activación infrarroja de papaína en microcuentas [J]. Biotecnología, 1993, 3(5): 17-20.

[14] Chen Fangyan, Ji Pingxiong. Estudio sobre las características de la papaína fija en seda [J]. Journal of South China Agricultural University, 2005, 26(4): 81-83.

[15] Huang Yibing, Wu Xiaoxia, Wu Shengnan, et al. Estudio sobre la inmovilización de papaína usando Ovalbumin como portador [J]. Journal of Jilin University, 2004, 42(4): 15-20.

[16] Huang Jianshao, Zhang Hong. Chitosan-inmovilizpapain [J]. Journal of Changde Normal University (Natural Science Edition), 2002, 14(1): 36-39.

[17] Yuan Chuntao, Jiang Xianming. Study on chitosan-g-acrylonitrile-inpapain [J]. Applied Chemistry, 2002, 19(9): 28-31.

[18] Liao Qiu Hua. Estudio sobre la inmovilización de papaína por quitosano microcristalino [J]. Journal of Guangzhou Military Medical College, 1998, 21(1): 30-32.