¿Qué es la biosíntesis de vanilina?

Vanillin es el principal componente de vainilla, también conocido como Vanillin, Vanillin, Vanillin aldehído, etc. El nombre químico es 4-hidroxi3-metoxibenzaldehído (4-hidroxi3-metoxibenzaldehído), masa molecular relativa 152.15, polvo cristalcristalblanco a amarillo claro o cristal de aguja. La vainillina existe en la planta en forma libre y como glucósi, representando del 2% al 3% del peso seco de las vainilla. La vainillina pura tiene un fuerte aroma lechoso y ningún olor. La vainillina tiene una amplia gama de usos, además de ser utilizada como agente de perfume y saborizante, también es una importante materia prima e intermedia en la industria farmacéutica, y también se puede utilizar como un barniz para galvani, promotor del crecimiento de las plantas, agente de maduración, etc.

La vainillina es la especie sintética más grande del mundo, con un consumo anual de alrededor de 12.000 t, y su demanda sigue aumentando a un ritmo del 10% anual. La producción de vainillina natural extraído y preparado a partir de vainilla es baja, sólo alrededor de 20~50 t por año, y la brecha de consumo restante se llena por el método de síntesis química, que tiene muchos inconvenientes inevitables, tales como aroma único, fácil de ser adulter, etc., pero people&#La demanda de vainillina natural está siempre en aumento.

La demanda de vainillina natural es cada vez mayor. Dado que el cultivo de vainilla está restringido por las condiciones climáticas y geográficas, y el procesamiento de su aroma es complicado, es difícil para la producción de vainillina satisfacer la demanda del mercado. Los métodos biológicos pueden sintetizarVanilina natural[1], y tienen las ventajas de menos contaminación, producción más limpia y seguridad. En la actualidad, los métodos biológicos descritos incluyen la fermentación microbiana, el cultivo de células vegetales y el método enzimático.

1 fermentación microbiana

En 1977, Tadasa K aisló una cepa de Corynebacterium sp. que podría convertir eugenol en vanillin [2], lo que abrió una nueva manera de preparar vanillin biológicamente. Posteriormente, se descubrió que muchas bacterias y mohos eran capaces de convertir el eugenol, isoeugenol, ácido ferúlico, glucosa y otros compuestos en vanilina, y la vanilina podría ser sintetizpor fermentación microbiana utilizando una variedad de sustr.

1. 1 Eugenol o Isoeugenol como sustr.

El Eugenol y su isómero isoeugenol, derivado principalmente del aceite volátil de albahaca de clavo de labiata, el nombre químico de Eugenol es 4-propenil-2-metoxifenol [2-metoxi4 -(2- propenil) -fenol], y el nombre químico de isoeugenol es 4-propenil-2-metoxifenol [2-metoxi4 -(1- propenil)- fenol]. El nombre químico de isoeugenol es 4-propenil-2-metoxifenol [2-metoxi4 -(1-propenil) -fenol], los cuales pueden ser química o biolconvertido en vanillin. Además de Corynebacterium sp., Serratia sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., y algunos hongos de la clase de Hemiptera también son capaces deConvirtiendo eugenol en vanillin[3, 4]. Además, Serratia marcescens, Klebsiella marcescens y Enterobacter marcescens pueden convertir isoeugenol en vanillina. Bacillus subtilis y Rhodococcus subtilis también son capaces de convertir isoeugenol en vanillina.

Rhodochrous) también posee la capacidad de convertir isoeugenol en vanillin [5, 6].

La conversión de eugenol a vanillina por cepas fúnde de la clase Hemiptera no produjo altos rendimientos, con un máximo de 0.0271 g/L [4]. La cepa Bacillus subtilis B2 puede utilizar isoeugenol como única fuente de carbono y convertirlo en vanillina con un rendimiento de 0,61 g/L y un rendimiento molar (en términos de isoeugenol) de 12,4% [5]; Cuando la cepa de B. purpurea MTCC 289 utiliza isoeugenol como sustr, bajo condiciones óptimas de cultivo en laboratorio, el rendimiento molar de vanilina (en términos de isoeugenol) puede ser tan alto como 58% [6].

Aunque también se utilizó la cepa de Serratia marcescens DSM 30126, los resultados variaron mucho dependiendo del sustr[3]. El rendimiento molar de vanilina (en términos de eugenol) fue de solo 0,1% con un rendimiento de 0.018 g/L, mientras que el rendimiento de vanilina (en términos de isoeugenol) fue de 20,5% con un rendimiento de 3,8 g/L. Por el contrario, el rendimiento de vanilina obtenido mediante el uso de isoeugenol como sustrfue de 20,5%, y el rendimiento de vanilina obtenido mediante el uso de isoeugenol como sustrfue de 20,5%. En contraste, el rendimiento de vanilina obtenido con isoeugenol como sustrfue mayor que el obtenido con eugenol como sustr, que también fue el resultado de los autors' Fermentación con Serratia marcescens cepa AB 90027. El Isoeugenol es un sustrmás adecuado que el eugenol para la producción de vanilina por fermentación microbiana.

1. 2 ácido ferúlico Como sustr

El ácido ferúlico, conocido químicamente como ácido 4-hidroxi3-metoxicinnámico, se encuentra ampliamente en subproductos agrícolas como el gluten de maíz y el salvado de grano. Hay dos maneras de producir vainillina por fermentación usando ácido ferúlico como sustr: una requiere la acción de una sola bacteria, mientras que la otra requiere la acción combinada de múltiples cepas de bacterias.

Las cepas únicas de hongos utilizados para la producción de vainillina por fermentación se han reportado [4,7,8], incluyendo ciertos hongos del orden Bacillus coagulans, y hongos filamentosos del suelo (Amycolatopsis sP.). Solo 0.0552 g/L de vanillin se obtuvo mediante el uso de una cepa fúndel orden Hemiptera [4]. En contraste, la vanilina fue producida a partir de 4-vinilguaiacol por Bacillus coagulcepa BK 07, que utiliza ácido ferúlico como la única fuente de carbono. Esta cepa puede metabolizar más del 95% del ácido ferúlico en 7 h, y el producto principal es 4-vinilguaiacol, que es el proceso de metabolismo más rápido del ácido ferúlico reportado hasta ahora [7]. En el método patentinventado por Rabenhorst J et al. [8], se utilizó una bacteria filamentosa del suelo, cepa DSM 9992, para convertir ácido ferulico en vanillina con un rendimiento tan alto como 11,5 g/L. El mecanismo de este proceso aún no se ha informado.

El "método de bioconversión en dos pasos" Propuesto por Lesage-Meessen L et al [1] es un ejemplo típico de la producción de vanillin por la acción combinada de múltiples cepas, que utiliza Aspergillus niger y pycnoporus cinnabarinus para completar todo el proceso de conversión. Este método utiliza la combinación de Aspergillus niger y Pycnoporus cinnabarinus. En primer lugar, Aspergillus niger convirtió ácido ferúlico en ácido vanílico con un rendimiento de 0,92 g/L y un rendimiento molar de 88% en términos de ácido ferúlico, y luego redujo ácido vanílico a vanilina con un rendimiento de 0,237 g/L y un rendimiento molar de 22% en términos de ácido vanílico por Pycnoporus cinnabarinus. Recientemente, [9] cambiaron el ácido ferúlico a salvado de maíz como la única fuente de carbono, y crearon un "método de bioconversión de dos pasos" Para obtener cristales de vainilina sin ninguna medida de purificación.

Según el estudio [10,11], durante la reducción de ácido vanílico a vanilina por M. verticillioides, el rendimiento de vanilina se reducirá debido a la generación del subproducto metoxihidroquinona; Cuando la concentración másica de vanilina en el medio exceda de 1,0 g/L, será muy tóxica para M. verticillioides, lo que retrasará el crecimiento de M. verticillioides, y al mismo tiempo la gran proliferación de esta cepa no favorece la producción de vanilina. La adición de cellobioa a este sistema redujo significativamente la producción de hidroximetoxiquinona y aumentó el rendimiento de vanilina en 3,3 veces a 0,725 g/L. La adición de una cantidad adecuada de resina XAD-2 adsoradsorvanillin podría regular la concentración de masa de vanillin en el medio y la tasa de crecimiento de la cepa, y el uso de biorreactor agitmecánicamente podría mejorar en gran medida el efecto de transferencia de masa, y el rendimiento de vanillin podría alcanzar 1.575 g/L. Los resultados mostraron que la producción de vanilina en este sistema no era favorable a la producción de vanilina, y podría ser utilizado en la producción de vanilina.

1. 3 glucosa como sustr.

La glucosa se puede obtener a partir de la hidrólisis del almidón, que es una materia prima suficiente con bajo costo, pero solo existe un caso de biotransformación de la glucosa como sustrpara producir vanilina [12]. En primer lugar, la glucosa fue convertida en ácido vanílico por recombinantes de Escherichia coli (Escherichia coli KL7/PKL5. 26A o KL7/PKL5. 97A), y luego el ácido vanílico fue reducido por aldehído deshidrogenasa aroaislado de Neurospora crassa para producir vanilina. Con el fin de hacer del método de bioconversión de glucosustruna tecnología de aplicación industrial para la producción de vanilina natural, la expresión estable de recombinantes en E. coli debe ser resuelto.

En resumen, aunque la glucosa es barato, cómo realizar la expresión estable de los recombinantes de E. coli es la clave para la aplicación práctica; Desde el punto de vista de los recursos de materias primas y el estado actual de la biotecnología en China, la bioconversión de isoeugenol y ácido ferúlico como sustrpara la producción de vanilina tiene perspectivas de desarrollo más prometedoras.

Método de cultivo de 2 células vegetales

El desarrollo de la tecnología moderna de bioingeniería ha llevado a la idea y la práctica de utilizar cultivos celulares para producir vainilina. El primero fue el cultivo artificial de células de vainilla planolia, que utilizó la propiedad de exocitosis de vanilina por las células, pero el rendimiento por unidad de volumen no fue alto, sólo alrededor de 0,01 g/L [13]. Recientemente, se han encontrado nuevos métodos para convertir aditivos específicos en vainilina, como capsicum 'rutescens cells' [14-16].

Estos cultivos celulares y su producción de vanilina se ven afectados por factores como aditivos y ambiente de crecimiento celular [17]. Cao Mengde et al. [13] encontraron que la adición de diferentes tipos y concentraciones de fitohormonas no tuvo un efecto significativo en el crecimiento celular, pero tuvo un efecto significativo en la producción de vanilina, y la combinación de ácido naftaleno acético y 6-benil-adenina resultó en la producción de más vanilina. La formación de vanilina se correlaciona negativamente con el crecimiento celular, es decir, el crecimiento celular lento favorece la formación del producto objetivo, por lo tanto, un método de cultivo de dos pasos puede ser considerado para el cultivo de células de vanilina y la producción de vanilina [18].

Además de las células vegetales productoras de Vanina en cultivo en suspensión, también hay células de pimienta armatosa y células de Haematococcus pluoialis que pueden convertir aditivos en vanilina [14-16]. Debido a las desventajas del cultivo en suspensión celular, tales como la posición celular no fija, la organización celular desfavorable y la dificultad para controlar las condiciones de cultivo, el rendimiento de la vanilina no es alto, lo cual puede ser mejorado por el cultivo de inmovilización celular, de modo que el rendimiento de vanillin puede ser aumentado.

Como se mencionó anteriormente, las células de chilshrubby pueden convertir algunos aditivos específicos, tales como isoeugenol, aldehído protocatechuic, y ácido cafeico, en vanillin. La tabla 1 muestra la producción máxima de vanilina y su ocurren relación a los aditivos durante la inmovilización de las células de chili armatoso [14,15].

Se puede ver que el isoeugenol es el mejor de los tres aditivos, y es más eficaz si se añade la ciclodextrina para mejorar la solubilidad del isoeugenol y reducir su toxicidad a las células, o si se añade el miceliaspergillus niger como inductor. Similar a las células de pimienta arborrosa, las células de R. rainbowii también pueden convertir ácido ferúlico o trementina en vanilina [16]. El rendimiento máximo de vanillina fue de 0,0106 g/L con la adición de ácido ferúlico (a una concentración de 1,0 mmol/L) y 0,0205 g/L con la adición de aldehído de trementina (a una concentración de 1,0 mmol/L) durante el proceso de solidificación. En conclusión, las eficiencias de los cultivos celulares vegetales existentes para la producción de vainilina no son altas, y aún están lejos de la industrialización.

3

Todas las reacciones biometabólicas son enzim, y aunque el mecanismo de acción de los distintos métodos descritos anteriormente no está aún claro, se puede determinar que son producidas por la acción de una o más enzimas. Si estas enzimas pueden ser aisladas y utilizadas en reacciones enzimáticas, la vanilina puede ser producida más directamente.

Van den Heuvel Robert H H et al. [19] de la universidad de Wageningen, países bajos, encontraron que la vanilina puede ser producida por vanilyl alcohol oxid(VAO) de dos maneras. Una es la producción de vanilina a partir de alcohol de alquitrán de madera a través de alcohol vanilílico en presencia de VAO. En el otro caso, la vanililamina es convertida por VAO bajo condiciones alcalinas a un producto intermedio que puede ser hidrolizado directamente a vanilina. Dado que el pimiento rojo y la capsaicina pueden ser degradados enzímicamente para producir vainilina, esta última ruta proporciona una fuente más rica de materia prima y la hace más competitiva. Una patente [20] informó que la enzima llamada chirazyme L 20] informaron que una lipasa llamada chirazyme L-2, c-f, C2 lyo fue capaz de convertir isoeugenol y aldehído de pino a vanilina con fracciones de masa de 30,4% y 83,1%, respectivamente, y que esta lipasa también podría ser aislada de la Candida antártica.

Debido a las ventajas de alta eficiencia, especialización, condiciones de reacción suaves, fácil purificación de productos, bajo consumo de energía, baja contaminación, operación simple y fácil control, la reacción digital debe tener superioridad incomparable. Sin embargo, cómo hacer uso de la teoría de enzimas, ingeniería química y biotecnología moderna para modificar las enzimas existentes, estudiar su tecnología de inmovilización y desarrollar un reactor multi-enzimadecuado será la tarea principal para la producción de vanillin por método enzim.

4 conclusión

La producción de vanillin por método biológico está recibiendo cada vez más atención, y muchas famosas compañías productoras de vanillin en el mundo, como Schniken (Italia), Boreai (Noruega) y Monsanto (EE.UU.), han reforzado la investigación sobre la producción de vanillin por método biológico, con el fin de ocupar una posición dominante en el mercado de especias en el futuro. China se encuentra todavía en la etapa inicial en este aspecto, en la actualidad, sólo hay la investigación de Cao Mengde de la universidad Huazhong de ciencia y tecnología sobre el cultivo de suspensión de células de vanillin, y la investigación de Yao Risheng de la universidad Hefei de tecnología sobre la producción de vanillin por el método de bio-oxiden conjunto con Xiamen Yongquan Group Company Limited.

Por lo tanto, es necesario aprovechar la combinación de los métodos de producción, aprendizaje, investigación y financiamiento gubernamental, e intensificar la investigación de la cooperación, para que nuestro país ocupe un lugar en el mercado de la vanilina biosintetiz. Por lo tanto, es necesario aumentar la investigación cooperativa con la ayuda de la combinación de la industria, la Academia, la investigación y la financiación del gobierno, para que China pueda ocupar un lugar en el mercado de la vainillina biosintética.

Aunque la investigación sobre la síntesis no química de la vanilina ha hecho muchos progresos sustanciales, los problemas siguientes todavía necesitan ser resueltos para realizar la producción industrial: Mejorar la tecnología de cultivo de células vegetales; Investigación sobre la tecnología de aislamiento, purificación e inmovilización de enzimas, así como el desarrollo de reactores multienzimáticos. De acuerdo con el estado actual de la técnica, el costo de producción de vainillina por cultivo de células vegetales será tan alto como 15.000 dólares /kg, mientras que el costo de extraer vanillin de vainilla por métodos tradicionales es de 4.000 dólares /kg, y el costo de usar fermentación microbiana es de cerca de 1.000 dólares /kg [17]. Por lo tanto, la investigación y el desarrollo de la fermentación microbiana de la vanilina utilizando isoeugenol y ácido ferúlico como sustrserá más prometedor para la producción de vanilina en China.

Referencias:

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