¿Cuáles son los métodos de prueba de polvo de galactooligosacárido?

Los galactooligosacáridos (GOS) se forman mediante la vinculación de 2 a 8 monosacáridos a través de enlaces − -glicosídicos para formar un oligosacárido de cadena recta. No pueden ser digeridos y absorbidos en el tracto digestivo superior del cuerpo humano, y pueden entrar directamente en el intestino grueso. Después de una extensa investigación por científicos en el país y el extranjero, los galacto-oligosacáridos se han encontrado para tener una serie de beneficios nutricionales, incluyendo baja energía, promover el crecimiento de bifidobacterias en los intestinos, mejorar la absorción de minerales y prevenir la osteoporosis, mejorar el metabolismo de los lípidos, prevenir y tratar el estreñimiento, ser menos cariogénico, la generación de nutrientes, mejorar el estado nutricional, aumentar la inmunidad, mejorar el anti-tumor y anti-envejecimiento efectos, Etc. [1-2].

Los galacto-oligosacáridos han sido ampliamente utilizadosEn Japón como edulcor, sustituto del azúcar, ingrediente alimenticio y ingrediente funcional, y se añaden a varios tipos de alimentos. El Ministerio de salud del pueblo#39;s República de China ha aprobado los GOS como un nuevo alimento de recurso y permite que se agregue a los alimentos infantiles, productos lácteos, bebidas, productos horneados y dulces (Ministerio de salud de la gente 's República de China anuncio n º 20 de 2008, Ministerio de salud del pueblo#39;s República de China anuncio No. 12 de 2007) [3].

Debido a que los galacto-oligosacáridos seluna mezcla de oligosacáridos a base de galactosa con un grado de polimerique va de 2 a 8 y más de 15 componentes [4], hay ciertas dificultades para detectarlos utilizando estándares externos, por lo que la tecnología de detección de galacto-oligosacáridos es el foco de la investigación en la detección de oligosacáridos. A continuación se describe el estado de la investigación, los problemas y las direcciones de investigación de la tecnología de detección de galacto-oligosacáridos en el país y en el extranjero.

1 estado de investigación de los métodos de detección de oligosacáridos

Los galacto-oligosacáridos son oligosacáridosY la tecnología de separación y detección de oligosacáridos siempre ha sido el foco de la investigación por los investigadores científicos. En 1986, Takamitsu chaka etal [6] utilizaron cromatode capa delgada para separar los oligosacáridos de alginato, y Splechtna B etal [7 utilizó cromatode capa fina para analizar los oligosacáridos en productos de transglicosilación.

Se han realizado relativamente más estudios sobre las técnicas de separación y detección de oligosacáridos utilizando cromatolíquida de alto rendimiento (HPLC) [8]. HPLC utiliza principalmente las características de los oligosacáridos, que son fácilmente soluy se pueden separar eficazmente en columnas de azúcar, columnas de aminoácidos y columnas de gel. Generalmente se detecta usando un detector de índice de refracción diferenciAl.Con el progreso de la tecnología, Antonopoulos A etal [9] utilizó un detector de dispersión de luz evapor(ELSD) para detectar oligosacáridos. El límite de detección del ELSD es 1-2 órdenes de magnitud más alto que el del refractómetro diferencial, y tiene mejores perspectivas. Hirotaka Kakita et al [10]derivatized monosaccharides and oligosacárides confluorescein and usandoHPLC method detection lograron buenos resultados.

Con el desarrollo de la tecnología, también se han realizado estudios sobre la separación y análisis estructural de oligosacárimediante espectrode masas. Lin Qinbao et al. [11] usaron cromatode gases y espectrode masas para determinar la composición de monosacáridos de los oligosacáridos de jujube. Los resultados mostraron que la composición monosacáride de los oligosacáridos de jujube era arabinosa, rinosa, ribosa, manosa, galactosa y glucosa. Al mismo tiempo, la composición de monosacáridos en jujube era fructosa y glucosa, lo que logró buenos resultados. Broberg A [12] utilizó cromatolíquida de alto rendimiento espectrode masas con trampa de iones en tándem para el análisis de oligosacáridos. Ying Liu et al [13]utilizaron cromatolíquida y cromatolíquida en tándem electrospray ioniespectrode masas para la separación e identificación de oligosacáridos.

Además, Feng Yongmei et al. [14] usaron una columna de resina de intercambio catiónico 001 − 7 para separar y purificar una mezcla de oligosacáridos (GOS), y luego usaron cromatode capa delgada para analizar los resultados de la purificación. Kamoda S et al. [15] usaron un detector de fluorescindupor láser para analizar oligosacárivinculados an separados por electroforesis capilar, y también lograron buenos resultados. Dreisewerd K et al [16]también obtuvieron buenos resultados utilizando cromatode capa fina para separar oligosacáridos de cow& raw#39;s leche, y luego usando la desorción láser asistida por matriz/ioniespectrode masa de tiempo de vuelo para el análisis.

A continuación se presenta una introducción detallada de los métodos de detección de galacto-oligosacáridos, que se basan en los métodos analíticos más estudiados: cromatode capa fina, cromatode gases, cromatode líquidos y cromatode iones.

1.1 cromatode capa fina

Li Yumei et al. [17] analizaron un producto de fermentación de transglicosilación de galactosidasa con un contenido de galactooligosacárido de 30%. Se utilizaron dos métodos: cromatode capa fina y HPLC. Para la cromatode capa fina, se utilizó una placa de gel de sílice 60, y el disolvente en desarrollo fue n-butanol: etanol: agua = 5: 3: 2 (por volumen). El colorera era 20% solución de ácido sulfú+ 0,5% 3,5-dihidroxitolueno. El azúcar se horneaba a 120 °C durante 3-5 min, y luego el software ImageJv1.28 para el análisis cuantitativo.

Lu Wenwei et al. [18] utilizaron cromatode capa delgada y ajustel agente desarrollador a: n-butanol: n-propanol: etanol: agua = 2: 3: 3: 2 (relación volumen) para analizar el contenido de galactosa oligosacári(contenido superior al 20%) en el producto de transglicosilación.

Xu Mudan et al. [19] utilizaron cromatode capa delgada ascendente con una capa G de gel de síy n-butanol: agua = 85:15 como disolvente de desarrollo para detectar el contenido de cada componente de azúcar en los productos de transglicosilación (contenido de oligosacárido de galactosa superior al 20%) utilizando una solución de ácido fosfórico de anilina-difenilamina como reveldel color.

Li Zhengyi et al. [20] usaron el mismo método de cromatografía de capa delgada que Li Yumei et al. [17] para analizar el contenido de oligosacáridos en la leche baja en lactosa. Debido a la alta tasa de hidrólide de lactosa, que superó el 70%, el contenido de GOS superó el 20%, por lo que hubo muy poca interferencia de la lactosa. Se utilizó la columna de análisis de azúcar Aminex HPX-42C (300 mm × 7,8 mm), y las condiciones de HPLC fueron las siguientes: agua ultra pura como fase móvil, temperatura de columna 70 × C. Los picos cromatográficos de los disacáritransferidos y lactosa se superpusieron, resultando en un resultado de detección más bajo para el contenido de galactooligosacárido y un resultado de detección más alto para el contenido de lactosa.

Wu Hao et al. [21] realizaron un estudio sistemático sobre el análisis de oligosacáridos y sus derivados mediante cromatode capa fina de alto rendimiento. Se realizaron experimentos para optimizar el espesor de la capa delgada, el efecto sal de la fase estacion, la concentración del aglutinen gel de sílice, la técnica de muestreo por muestreo y la selección del agente revelador, y la optimización del revelador de color, etc., para determinar un método adecuado. Sin embargo, el método es adecuado para muestras con alto y bajo contenido de oligosacáridos y bajo contenido de lactosa y galactosa.

1.2 cromatode gases

Con el desarrollo de la cromatode gases y la tecnología de derivatización, algunas personas también utilizan la cromatode gases para separar y detectar carbohidratos. Debido al alto peso molecular y alto punto de ebullide los azúcares, los polisacáridos se hidrolizen primero en monosacáridos, y luego se utilizan reactivos de derivatización para derivar monosacáridos en sustancias que son fáciles de vaporizar, y la cromatode gases se utiliza para separar y cuantificar. Por lo tanto, la cromatode gases se utiliza principalmente para analizar la composición y contenido de los monosacáridos, y la operación es relativamente complicada.

Liu Jianfu [22-23] hidrolizó y derivatizó la muestra oligosacde galactosa separada y puriy la analizó usando cromatode gases. El experimento utilizó una columna capilar de cuarzo OV1701 (30 m, I.D. 0,32 mm), y la estructura aproximada del producto de separación se determinó con base en la relación de las áreas pico de la glucosa y galactosa medidas. Sin embargo, no se dio ningún método cuantitativo.

1.3 cromatografía líquida

La cromatolíquida de alto rendimiento es actualmente el método más común para la detección de monosacáridos y oligosacáridos. Los investigadores mencionados anteriormente también utilizaron la cromatolíquida en combinación con la cromatode capa fina para analizar los oligosacáridos en productos de transglicosilación. Por ejemplo, Li Yumei et al. [17] también usaron HPLC para analizar los oligosacáridos en los productos de transglicosilación. El jarabe se filtra a través de una membrana de filtro de 0,22 μm, y se utilizó agua tristillada como fase móvil. La temperatura de la columna fue de 80 °C, y se utilizó la columna de análisis de azúcar Aminex HPX-42A (300 mm × 7,8 mm). Lu Wenwei et al. [18] también utilizaron HPLC para determinar el contenido de oligosacárido galactosa en el producto de transglicosilación. La fase móvil era de 5 mmol/L de ácido sulfúrico, la temperatura de la columna era de 50 °C, y la columna era Aminex HPX 87H.

Barroso Begoña et al [24] usaron cromatolíquida de alto rendimiento/espectrode masas de tiempo de vuelo online para analizar la estructura y el tipo de oligosacáridos derivados de glicoproteínas, y analizoligosacáridos n-enlazados y o-enlazados, con buenos resultados.

Luo Qian et al. [25] estudiaron el método de derivación de oligogalactosa antes de la columna usando 1-fenil-3-metil-5-pirazolona (PMP), y usaron cromatode columna de gel de sílice combinada con cromatode capa delgada para separar y detectar oligogalactosa en jarabe de azúcar crudo. Utilizando un detector UV a 245 nm de longitud de onda, galactosa, glucosa lactosa, trisacáridos, tetrasacáridos y pentasacáridos. Este método puede utilizarse para la cuantificación indirecta.

Wu Hongjing et al. [26] utilizaron una cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa con agua como fase móvil para separar y analizar una mezcla de almidón que contenía polímeros de glucosa 2-6 obtenidos por hidrólisis enzim, y también lograron buenos resultados.

Li Jingfang et al. [27] estudiaron el método para determinar el contenido de oligogalactosa en productos lácteos y jarabes mediante cromatolíquida de alto rendimiento. El agua y el acetonitrilo se utilizaron como fase móvil, y una columna amino se utilizó para separar la glucosa, la galactosa y la lactosa de otras sustancias. El contenido de oligogalactosa en la muestra se calculó midiendo y calculando el contenido de galactosa producida por hidrólisis enzimde oligogalactosa. Las desviaciones estándar relativas de glucosa, galactosa, lactosa y oligosacárido fueron 2.72%, 4.16%, 1.16% y 4.26% respectivamente. El coeficiente de correlación lineal de este método fue de 0,9990-0,9995, y la tasa de recuperación fue de 95% a 110%. Este método no resuelve el problema de separar la galactosa y la glucosa en la solución de la muestra después de la hidrólisis, ni determina el factor de conversión para convertir la galactosa en oligosacáridos, por lo que es de importancia limitada.

Cromatografía de 1,4 iones

La cromatoiónica es una técnica relativamente nueva para la detección de monosacáridos y oligosacáridos. Tiene las ventajas de una alta sensibilidad y una buena eficiencia de separación. El método de cromatode iones para la detección de galacto-oligosacáridos fue publicado por primera vez como un método estándar oficial por la American AOAC. Otras investigaciones sobre el método de cromatoiónica para la detección de galacto-oligosacáridos se centran principalmente en la mejora del método estándar AOAC.

American AOAC 45.4.12-2001.02 standard (en inglés) 

La base teórica para la norma AOAC 45.4.12-2001.02 "determinación de trans-galactooligosacáridos (TGOS) en productos alimenticios seleccionados" es el uso de una específica y exclusiva − -galactosidasa para hidrolizar la lactosa y los galacto-oligosacáridos en la muestra, con glucosa y galactosa como productos. El contenido de galactosa de la hidrólisis de la lactosa se calcula utilizando el contenido de lactosa detectado en la muestra. Contenido de galactosa procedente de la fuente de hidrólisis de lactosa. Finalmente, el contenido total de galactosa en la solución de la muestra se resta del contenido de galactosa libre y derivado de la hidrolactosa, y luego el incremento de galactosa se multiplica por un factor para calcular el contenido de galacto-oligosacáridos (GOS) en la muestra. Los pasos de operación y cálculo de esta norma son los siguientes:

- medir la cantidad de galactosa libre y lactosa utilizando IC;

→ calcular la cantidad de galactosa derivada de la lactosa;

- hidrolizar la lactosa y los TGOS en la muestra;

- medir la cantidad de galactosa total en el hidrolizado utilizando IC;

− calcular GALGOS = GALT - GALfree - GALLAC;

− calcular TGOS = k − GALGOS.

Nota: aquí k = (180 + 162 n)/(180 n), donde n es el número promedio de unidades de galactosa en una molécula de oligosacárido galactosa.

Este método estándar de detección de oligosacáridos galactosa presenta dos problemas técnicos:

(1) el factor de cálculo en la norma AOAC 45.4.12-2001.02 se calcula a partir del grado de polimerización de oligosacáridos. Sin embargo, en pruebas prácticas, el grado de polimeride de los oligosacáridos no puede ser medido con precisión debido a la complejidad de los componentes oligosacáridos causados por diferentes procesos de producción. Debido a que no hay un factor de conversión uniforme, este método sólo puede dar una idea del método de prueba y es de poca importancia para la generalización.

2) debido a que la base cuantitativa es el aumento de galactosa en la muestra, la cantidad de lactosa o carbohidratos que contienen galactosa en la muestra a analizar es el factor más importante que afecta ala precisión de los resultados de la prueba (como se explica en la norma). El contenido de lactosa de los alimentos, especialmente la leche en polvo (− 40 g/100 g), es mucho mayor que el contenido añadido de GOS (− 1 g/100 g), por lo que el contenido de galactosa derivado de la hidrólisis de la laces superior a 20 g/100 g. El contenido de galactosa obtenido a partir de la hidrólisis de GOS no es superior al 5% del contenido total de galactosa. Del análisis de los resultados del tratamiento de la muestra y del análisis instrumental, este aumento del 5% puede considerarse como muy buenos resultados paralelos. No puede usarse para calcular el contenido de GOS,por lo que este método no es adecuado para muestras con alto contenido de lactosa.

1.4.2 otros métodos de detección por cromatode iones

Los estudios sobre la determinación del contenido de galacto-oligosacárido mediante cromatoiónica se basan básicamente en la norma AOAC 45.4.12-2001.02. Las principales investigaciones se han realizado sobre el tipo de columna, el gradiente y concentración de la fase móvil, la cantidad de − -galactosidasa añadi, etc. Algunos investigadores también han utilizado la cromatografía-espectrode masas para algunas investigaciones.

Bruggnk C et al [29] usaron cromatode intercambio iónico y espectrode masas cuadrupolar simple en tándem para estudiar la separación y análisis de monosacáridos, disacáridos, trisacáridos y oligosacáridos en muestras de café de achicoria, miel y cerveza.

Li Jianwen et al. [30] determinaron el contenido de oligosacáridos en jarabe de azúcar crudo mediante cromatode iones de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada basada en el método AOAC-2001.02 y optimizaron el gradiente del eluente.

Xu Li et al. [31] estudiaron el método para determinar el contenido de oligogalactosa en jarabe mediante cromatoiónica con una columna de CarboPac PA10 (2 mm × 250 mm) y un detector amperométrico utilizando un gradiente de elución con agua, 250 nmol/L solución de NaOH y 1 mol/L solución de acetato de sodio como método de referencia AOAC-2001.02. Se determinó el contenido de cada componente (lactosa, galactosa, glucosa y oligogalactosa) en el jarabe. El contenido de cada componente (lactosa, galactosa, glucosa y oligosacáridos) en el jarabe.

2 problemas con los métodos existentes

2.1 versatide la muestra

Aunque hay muchas técnicas para la detección de galacto-oligosacáridos, se utilizan principalmente para muestras con alto contenido de galacto-oligosacárido, como jarabe crudo de galacto-oligosacárido y productos de azúcar invertida. Incluyendo normas AOAC, las muestras de alimentos involucrados son también principalmente la detección de galacto-oligosacárido contenido en muestras de alimentos con bajo contenido de lactosa y bajo contenido de galactosa.

2.2 aplicabilidad del método normalizado externo

La producción industrial de lactasa utiliza diferentes fuentes, y los procesos de producción utilizados por cada fabricante también difieren en cierta medida, lo que resulta en la complejidad de los tipos y proporciones de los componentes oligosacáridos. El uso de métodos estándar externos para la detección presenta dificultades técnicas tales como la dificultad de preparar normas y los altos requisitos técnicos para la separación cromatográfica. Por lo tanto, es poco probable que el método estándar externo pueda ser utilizado para la investigación de métodos de detección.

2.3 factor de conversión empírico

− -galactosidasa se utiliza para hidrolizar la lactosa y los oligosacáridos en la muestra, y el contenido de oligosacáridos en la muestra se calcula por el aumento de galactosa. Un factor de conversión debe ser calculado utilizando el número promedio de unidades de galactosa (grado medio de polimeride de las unidades de galactosa) en los oligosacáridos en la muestra. Debido ala complejidad de la composición de los oligosacáridos, actualmente no existe un factor de conversión universal, por lo que incluso si se mide el incremento de galactosa de los oligosacáridos, no es posible calcular el contenido de oligosacáridos de la muestra.

2.4 contenido de lactosa en la muestra

Considerando la idea de utilizar el método AOAC-2001.02, debemos detectar el aumento de la cantidad de galactosa derivada de la galactosa oligomérica en la muestra. Por lo tanto, si el contenido de galactosa libre, lactosa u oligosacáridos que contienen galactosa en la muestra es muy alto, tales como productos lácteos, la eliminación de galactosa libre, lactosa u oligosacáridos que contienen galactosa en la muestra debe ser abordado. Sin embargo, este tema no fue estudiado en las investigaciones antes mencionadas.

3 dirección de investigación del método de detección de oligosacáridos en los alimentos

Como el único estándar publicado internacionalmente para la detección de oligosacáridos es AOAC 45.4.12 -2001.02 "determinación de trans-galactooligosacáridos (TGOS) en productos alimenticios seleccionados", no hay un estándar nacional o industrial para la detección de oligosacáridos en China. Los resultados de otros estudios tienen más deficiencias cuando se aplican a la determinación de oligosacáridos en los alimentos. Por lo tanto, la investigación sobre el método de detección de oligosacáridos en los alimentos debe basarse en el método AOAC, centrándose en la solución de los dos problemas siguientes.

3.1 grado medio de polimerización de oligosacáridos comerciales

Mediante el estudio de la composición y proporción de oligosacáridos en las materias primas oligosacáridos comerciales, el grado medio de polimeride de oligosacáridos puede ser determinado y calculado, y luego un factor de conversión para calcular el contenido de oligosacáridos utilizando el incremento de galactosa puede ser calculado para resolver el problema de calcular los resultados del método AOAC.

Los principales métodos para determinar el grado medio de polimeride de oligosacáridos son la cromatolíquida de alto rendimiento, la cromatode iones y la espectrometría de masas.

El método HPLC puede usar análisis de grado de polimerización y análisis de columna de aminoácidos para calcular el grado de polimeripromedio de oligosacáridos usando el método de normalización de área. El método de cromatode iones requiere el uso de una columna adecuada para separar oligosacáridos para separar bien las materias primas oligosacáridas, medir el peso molecular (o grado de polimerización) de cada componente, y luego calcular el grado de polimeripromedio de oligosacáridos utilizando el método de normalización de área. Estos dos métodos se basan en la suposición de que el material oligosacárido utilizado para la investigación se convierte a partir de lactosa pura, que no contiene galactosa, glucosa u oligosacáridos distintos de los oligosacáridos derivados de la lactosa, que cada componente oligosacárido del material oligosacárido está bien separado, que se conoce el grado de polimerización de cada componente, Y que hay un cierto error debido a la suposición de que los valores de respuesta de cada componente son iguales.

La espectrometría de masas requiere medir la relación masa-carga de cada componente de oligosacáridos, determinar la abundancia de iones de diferentes relaciones masa-carga, y calcular el grado promedio de polimerización de oligosacáridos por la relación de abundancias de iones de cada grado de componente de polimerización. El objeto estudiado por espectrode masas debe ser también oligosacáridos derivados de la lactosa pura, que no deben contener oligosacáridos de otras fuentes. También es necesario asegurar que los disacáridos en lactosa y oligosacáridos estén bien separados, y que los valores de respuesta a la abundancia de iones de cada componente del grado de polimerison los mismos (lo más importante, el número de cargas en cada ion debe ser igual). También hay un cierto error.

Aunque hay algún error en los métodos anteriores para medir el grado de polimerización, mediante el análisis del nivel aceptable de error y la operabilidad del método de medición, debería ser posible establecer un factor de conversión para los oligosacáridos similar al de las proteínas.

3.2 estudio de la universde las muestras medibles

Debido a que el contenido de oligosacárido en la muestra debe ser calculado mediante la medición del aumento de galactosa en la muestra, el contenido de lactosa libre y galactosa en la muestra es un factor importante que afecta ala precisión del resultado de la medición. Si el contenido de galactosa de fondo es demasiado alto, la proporción relativa del aumento de galactosa obtenido después de la hidrólisis será baja, y el error de medición será relativamente grande.

Estudiar y resolver la interferencia de eliminar la lactosa y la galactosa libres en el pretratamiento de las muestras puede mejorar la precisión de los resultados del ensayo y la universdel método de ensayo para las muestras, especialmente los productos lácteos. La eliminación de la lactosa y la galactosa libres en la muestra puede ser considerada por extracción en fase sólida, microbiología y técnicas de preparación cromatográfica. Sin embargo, debido a que la sustancia objetivo y la lactosa y la galactosa son azúcares con la misma estructura, esta investigación será más difícil y requerirá una mayor inversión.

Además, el efecto de los iones cargados en la muestra, especialmente los iones divalentes, en la columna de cromatode iones debe ser considerado durante el pretratamiento de la muestra, y la tecnología de remode estos iones debe ser estudiada.

4 conclusión

Aunque la investigación sobre la tecnología de detección de oligosacáridos es un reto, con la mejora continua de people&#Los alimentos añadidos con oligosacáridos serán cada vez más valorados por los consumidores. El desarrollo y producción de alimentos añadidos con oligosacáridos con funciones probióticas será la tendencia de desarrollo. La situación actual de la calidad y seguridad de los alimentos a nivel nacional y de los consumidores#39; Cada vez mayor demanda de calidad de los alimentos, es particularmente importante investigar y desarrollar un método de detección del contenido de oligosacáridos en los alimentos. La investigación y el desarrollo de un método normalizado de ensayo del contenido de oligosacáridos en los alimentos no sólo proporcionará a las empresas métodos de ensayo adecuados y reforzará el control del proceso de producción; También proporcionará métodos de ensayo para los departamentos de supervisión e inspección de la calidad de los alimentos y proporcionará una referencia para la investigación sobre las técnicas de ensayo de otros componentes oligosacáridos en los alimentos.

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