¿Cuáles son las fuentes de los carotenoides?

carotenoides, due to their antioxidant and anticancer properties, have been widely applied in the pharmaceutical, healthcare, food, and cosmetics industries [1]. Their primary sources include microalgae, higher plants, microorganisms, and certain animals. Since the types of carotenoids present in each type of algae or plant vary significantly, different extraction methods must be employed to isolate various carotenoids from different algae or plants. Astaxanthin and β-carotene extracted from microalgae have already been commercialised. In recent years, the demand for carotenoids has significantly increased. According to statistics, the compound annual growth rate (CAGR) of the carotenoid market value from 2016 to 2021 was 3.5%; by 2021, the global production value could reach 1.52 billion USD [2].

El desarrollo económico ha mejorado a la gente#39;s mayor énfasis en la nutrición y la salud, y una mayor demanda de carotenoides. Además, en comparación con los carotensintetizquímicamente, los carotensintetiznaturalmente son los más favorecidos. Sin embargo, debido al bajo contenido de carotenoides en algas y plantas, incluso con el desarrollo continuo de tecnologías de extracción, sigue siendo difícil satisfacer la creciente demanda de carotenoides naturales. El continuo avance de las tecnologías de biología sintética ha promovido significativamente la síntesis de carotenoides y carotenoides desauxiliares en células huésped microbi[3]. La fuerte naturaleza hidrofóbica de los carotenoides los hace fácilmente integrados en las membranas de bicapas fosfolipí, lo que plantea desafíos significativos para las células huésped y, hasta cierto punto, limita la selección de células huésped adecuadas para la síntesis de carotenoides [4]. Con la mayor elucide la vía de síntesis de carotenoides, la mayoría de las enzimas y genes reguladores que participan en las reacciones catalíticas se han identificado. Esto proporciona una base teórica para la construcción de fábricas de células productoras de carotenoiy también proporciona apoyo científico para su aplicación generalizada en industrias como la medicina, cosméticos y alimentos.

1 fuentes y funciones biológicas de los carotenoides

Los carotenoides son diversos y están ampliamente distribuidos, encontrándose en las hojas y pétalos de plantas superiores, microorganismos y algas [5]. La mayoría de las moléculas de carotenoides tienen una cadena de polieno de doble enlace conjuc40 y un anillo de carbono terminal en su esqueleto molecular, y las características de cada carotenoide están determinadas por los tipos de anillos aromáticos y los grupos funcionales que contienen oxígeno [6]. Basándose en las características químicas estructurales y la presencia de grupos funcionales, los carotenoides se pueden clasificar en carotenos y xantofilas. Los carotenoides no solo regulan el crecimiento y el desarrollo de las plantas, sino que también tienen una estrecha relación con la nutrición y la salud humanas [7]. Son antioxidantes naturales con funciones preventivas y de alivio de enfermedades [8] y sirven como precursores para la biosíntesis de vitamina A (retinol).

1.1 fuentes de carotenoides

Natural carotenoids are primarily obtained from algae, plants, and microbial fermentation. In algae, Haematococcus pluvialis and Dunaliella salina can synthesise astaxanthin and β-carotene, respectively; Haematococcus pluvialis has the strongest ability to synthesise astaxanthin, with astaxanthin accounting for approximately 90% of the total carotenoids in the cell, and its weight can reach about 7% of the dry cell weight [9]. Bacteria and fungi can also synthesise carotenoids, such as Erwinia and Red Fife yeast [10]. The roots, stems, leaves, and petals of higher plants can also synthesise various carotenoids. Due to the natural carotenoid synthesis pathways in algae, microorganisms, and plant systems, they are ideal candidates for carotenoid synthesis cell factories.

Astaxantina pertenece a la clase de los ketocaroteny se encuentra ampliamente en algas, hongos y bacterias. Tiene tres isómeros ópticos: levo-astaxantina, dextro-astaxantina, y todo-trans-astaxantina. Diferentes isómeros exhivariaciones en la actividad antioxidante [11]. El − -caroteno está ampliamente distribuido en la naturaleza, con dos anillos − -carotenoides en su extremo terminal [12]. Existe principalmente en cuatro formas isoméri, y la principal diferencia entre sintetizde forma natural y sintetizquímicamente − -carotense encuentra en la proporción de todos los isómeros trans y cis [13]. La luteína se encuentra principalmente en las hojas y flores de las plantas verdes [14]. Su estructura química molecular incluye dos anillos cetónicos y tres centros quirales, con ocho isómeros coexistentes en la naturaleza. Participa principalmente en la captación de energía luminosa, en la regulación del crecimiento y desarrollo de las plantas, etc.[15]. La mayoría de las algas contienen luteína, como Clorella, Clorella vulgaris y Clorella vulgaris. Entre ellos, Clorella tiene el contenido más alto y es una cepa de algas ventajopara la producción de luteína [16].

1.2 funciones biológicas de los carotenoides

Los caroten, debido a sus fuertes propiedades antioxidantes, desempeñan un papel muy importante en la defensa antioxidante (tabla 1). Los estudios han demostrado que la adición de 250 mg/kg de peso corporal de luteína no sólo reduce eficazmente el daño oxidativo inducido por la radiación en ratones albinos, sino que también ayuda a mantener la estabilidad de su sistema antioxidante [17]. Además, diferentes carotenoides exhivariaciones significativas en la potencia antioxidante, y cuando se combinan en proporciones de concentración específicas, exhiefectos sinérgicos en la actividad antioxidante. Por ejemplo, cuando la relación de concentración de astaxantina a − -caroteno es 1:1, su efecto antioxidante sinérgico es más fuerte [18]; Cuando la relación de masa de zeaxantina a luteína es 2:1, su efecto antioxidante sinérgico es más fuerte [19].

Lutein and zeaxanthin are important components of the macular pigment in the human cornea, protecting the retina from blue light damage and enhancing visual acuity [20]. Therefore, lutein is commonly used in eye health supplements to prevent and alleviate age-related macular degeneration, cataracts, and retinal neural diseases [21]. When the intake of lutein and zeaxanthin is insufficient, the risk of macular degeneration increases [22]. Among carotenoids, astaxanthin and canthaxanthin exhibit better anti-cancer effects. Studies have shown that astaxanthin significantly reduces cancer incidence, inhibits malignant proliferation and metastasis of cancer cells, and reduces tumour weight and size [23]. Astaxanthin exhibits even higher anticancer activity. Studies indicate that astaxanthin-induced cell apoptosis is associated with reactive oxygen species (ROS), and ROS-induced cellular toxicity leads to the catalytic cleavage of caspase-3 and -9 [24]. Studies on prostate cancer have found that fucoxanthin and its metabolite fucoxanthinol can inhibit cell growth, induce apoptosis in prostate cancer PC-3 cells, and activate caspase-3 [25]. Fucoxanthin and fucoxanthinol can also induce tumour cell cycle arrest by regulating the expression of various molecules and signal transduction pathways [26].

2. Biosíntesis de carotenoides

2.1 Biosíntesis de los carotenoides

Las vías de síntesis de los carotenoides en las plantas han sido las más estudiadas. En los últimos años, los científicos han llevado a cabo análisis en profundidad de las vías de síntesis en microorganismos y algas, revelando que los diferentes organismos tienen distintas vías de síntesis, lo que resulta en diferentes tipos y rendimientos de carotenoides [28]. Las enzimas requeridas para la síntesis de carotenoides difieren entre las plantas y los microorganismos, con funciones más especializadas en las plantas. Por ejemplo, las enzimas responsables de catalizar la síntesis de octahidrolicopeno y la ciclación de licopeno se llevan a cabo por dos enzimas separadas en las plantas, mientras que en la levadura y los mohos, este proceso se completa con una sola enzima [29-30].

Aunque las microalgas se clasifican como plantas inferiores, poseen características de plantas superiores y microorganismos, lo que les permite sintetizar una amplia variedad de carotenoides. Pueden sintetizar beta-caroteny luteína, que son únicos de las plantas superiores, así como carotenoides como astaxantina y cantaxantina, que se encuentran comúnmente en los microorganismos. Por lo tanto, las microalgas tienen ventajas únicas para su uso como células huésped para la síntesis de carotenoides [31]. La elucide la vía de síntesis de carotenoides proporciona una base teórica para la construcción de fábricas de células de síntesis de carotenoides. La síntesis comienza con el compuesto precursor pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). La siguiente sección describe brevemente el proceso de síntesis de carotenoides utilizando plantas superiores como ejemplo (figura 2).

2.1.1 la vía biosintética de GGPP

La biosíntesis de GGPP es un paso crucial en la síntesis de carotenoides, y su proceso de síntesis puede ser simplemente dividido en dos pasos principales: la síntesis del precursor isopentenil difosfato (IPP) yla síntesis de dimetilalilo difosfato (DMAPP) a partir de IPP. Dependiendo de la localización de la síntesis, la vía de síntesis de IPP puede ser dividida en la vía del mevalony la vía del DMAPP. DMAPP); Y la síntesis de GGPP a partir del precursor IPP y DMAPP. Dependiendo de la ubicación donde se produce la síntesis, la vía de síntesis de IPP se divide en la vía del ácido mevalónico (MVA) [32] y la vía del metileritritol fosfato (MEP) [33], los cuales están compartimentados. Entre ellos, la vía del MVA se encuentra principalmente en la matriz citoplásmica y el retículo endoplásmico de la mayoría de los mamíferos y las células de levadura, con la acetila coenzima A como material de partida; La vía MEP está generalmente presente en los protoplastos de plantas superiores, algunas bacterias y algas [34], con 3-fosfoglicerato (GA-3-P) y piruvato como materiales de partida [35]. Después de la formación de IPP y DMAPP, los pasos catalíticos de las vías MVA y MEP son en gran medida idénticos.

2.1.2 síntesis de carotenoides a partir de GGPP

Starting from GGPP, enzymes involved in the synthesis of various carotenoids include oxidoreductases (EC1) such as PDS (phytoene desaturase) and ZDS (ζ-carotene desaturase), transferase enzymes (EC2) such as PSY (phytoene synthase), and isomerase enzymes (EC5) such as LCYe (lycopene ε-cyclase) and LCYb (lycopene β-cyclase), among others.

El proceso principal es el siguiente: primero, la GGPP es catalizada por PSY para sintetizar fitoeno, y otros carotenoides son derivados del fitoeno a través de la deshidrogenación y ciclación. PSY es la enzima limitante de velocidad clave en esta vía, con sus genes codificadores siendo CrtB en bacterias y PSY en eucariotas. Modular su nivel de expresión o actividad puede regular el flujo de la vía metabólica [36]. Por ejemplo, en la colza y los callos derivados de la patata, la sobreexpresión de la PSY constitutiva aumenta el contenido total de carotenoides en las células, y la síntesis de caroteno también se mejora significativamente [37].

Dado que PSY es un gen de una sola copia en la mayoría de las plantas, es un objetivo ideal para mejorar el contenido de carotenoides en las plantas utilizando técnicas de ingeniería genética [38]. En segundo lugar, octahidrolicopeno se convierte en − -carotenobajo la catálisis de PDS, y − -carotenoide se convierte en licopenbajo la catálisis de ZDS. Gao et al. [39] encontraron que la luz blanca puede inhibir la expresión de CpPDS y CpZDS en el callo del pomelo (Citrus paradisi), reduciendo así la síntesis de licopeno. Qin et al. [40] encontraron que después de la mutación del gen AtPDS3 en la vía de síntesis de carotenoides de la Arabidopsis, los niveles de expresión de genes como AtPSY y AtZDS disminuyeron significativamente, lo que llevó a una síntesis de carotenoides deficiente e inhibición de las vías de síntesis de clorofila y giberelina.

El licopeno se puede convertir en diferentes carotenoides bajo la catálisis de diferentes enzimas: bajo la catálisis de la CrtE, se puede ciclar para formar − -caroteno, que se convierte además en − -caroteno; Bajo la catálisis del CrtY, se puede convertir en − -caroteno, que se convierte en − -caroteno. Además, la TCRC puede catalizar la conversión de − -caroteno en − -caroteno. Los tipos de carotenoides sintetiza partir de GGPP son extremadamente diversos, constituun componente importante de la ruta natural de síntesis de carotenoides. Una comprensión completa de esta vía proveerá fundamentos teóricos para el diseño, modificación y aplicación de las vías de biosíntesis de carotenoides.

2.2 síntesis de carotenoides a xantofilas

La vía metabólica para la síntesis de pigmentos xantifila a partir de carotenoides requiere cinco tipos de oxidoreductasas, incluyendo LUT1 (carotenoide − -hidroxilasa), CrtZ (− -caroteno 3-hidroxil), LUT5 (− -anillo hidroxilasa), ZEP (zeaxantina epoxidasa), y VDE (violaxantina deepoxidasa). Después de sufrir reacciones consecutivas de hidroxilación, − -caroteno primero forma − -criptoxantina, que luego se convierte en zeaxantina.

Entre estos, el proceso por el cual la zeaxantina se somete a la apertura del anillo para formar flavoquinona, que luego se convierte en violaxantina, es reversible; Las enzimas que catalizan la reacción de dos pasos hacia adelante (es decir, la reacción de ciclación) son todas ZEP, y la reacción ocurre bajo condiciones débiles de luz u oscuridad. En la Arabidopsis, el gen que codifica esta enzima es AtABA1; Las enzimas que catalizan la reacción inversa de dos pasos (es decir, la reacción de desoxid) son todas ZEP, y la reacción ocurre bajo condiciones de luz fuerte; En Arabidopsis, el gen que codifica esta enzima es AtNPQ1, y todo el ciclo se conoce como el ciclo de luteína (ciclo de luteína) [41]. Actualmente, las enzimas catalíticas involucradas en cada etapa de la reacción han sido identificadas, especialmente en la planta superior Arabidopsis (tabla 2). El estudio de la vía de síntesis de carotenoide a luteína se puede utilizar para la evolución dirigida o métodos de respuesta al estrés para sintetizar tipos específicos de carotenoides.

3 construcción de fábricas de células de síntesis de carotenoides y estrategias de biología sintética

La vía de biosíntesis de los carotenoides se puede dividir en vías aguas arriba y aguas abajo, con el más básico IPP/DMAPP como nodo. El camino ascendente implica la síntesis de IPP y DMAPP, que se puede lograr a través de dos vías: MEP y MVA. La vía aguas abajo comienza desde IPP y DMAPP, experimenta múltiples reacciones y modificaciones, y finalmente sintevarios carotenoides y sus Derivados.

La construcción de una fábrica celular de síntesis de carotenoides es un proceso complejo que implica el ensamblaje y adaptación de múltiples módulos. Esto no sólo requiere la selección de componentes catalíticos adecuados basados en el producto objetivo, sino también, en algunos casos, la mejora de la síntesis de NADPH y ATP, el aumento de la oferta de precursores de GGPP, o la introducción de una vía exógena MVA para aliviar los efectos de inhibide retroalimentación de los intermediarios metabólicos [42]. Los componentes catalíticos requeridos para las rutas de síntesis de carotenoides incluyen varias enzimas que catalizan las reacciones químicas de la ruta, tales como sintasa, deshidrogenasa, ciclases, hidroxiasas y cetolasas. Para aumentar la producción de carotenoides, es necesario maximizar el flujo metabólico de los sustratos a los productos objetivo en las células huésped, al tiempo que se minimiza la producción de subproductos no esenciales o intermediarios metabólicos. Por lo tanto, es necesario seleccionar las células huésped óptimas y los componentes catalíticos y combinarlos de manera óptima de múltiples dimensiones, incluyendo las propiedades catalíticas, los niveles de expresión, y la adaptabilidad del huésped.

3.1 selección y modificación de células huésped de síntesis de carotenoides

El continuo desarrollo de tecnologías de biología sintética ha avanzado significativamente en la síntesis eficiente de carotenoides y sus derivados en células de chasis como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica (tabla 3). La mayoría de los carotenoides exhiuna fuerte hidrofobicidad, que conduce a un daño significativo a las estructuras de la membrana celular y perjudica las funciones fisiológicas celulares normales después de la síntesis dentro de las células [44]. Además, las estructuras de membrana limitadas en las células de chasis microbitambién restringen el potencial para aumentar los rendimientos de carotenoides. Además, las fuertes propiedades reductoras de los carotenoides pueden desencadrespuestas de estrés en las células del chasis, lo que conduce a un aumento significativo en los niveles intracde especies reactivas de oxígeno (ROS) y la inhibide retroalimentación del crecimiento celular [45].

Por lo tanto, el empleo de promotores inducibles para desacoplel crecimiento y la producción de cepas de producción [46], creando transportadores de ingeniería y sistemas de transporte de vesículas de membrana, puede promover el efflux de carotenoides, aliviar el estrés del sistema de membrana [47], y reducir el efecto de inhibide retroalimentación en la síntesis de carotenoides. El complejo ambiente interno de las células del chasis determina que la síntesis de los productos objetivo es inevitablemente influenciada por varios factores intracelulares. En particular, los genes endógenos no esenciales influyen significativamente en la capacidad de síntesis de carotenoides [48]. La regulación, diseño y modificación de genes no esenciales en la célula huésped puede mejorar la compatibilidad entre los módulos de expresión exógena y su entorno interno, mejorar la tolerancia celular, y fortalecer el flujo metabólico en la vía de destino.

Sin embargo, considerando el número limitado de genes no esenciales que pueden ser diseñados racionalmente y su impacto limitado en el ambiente interno, se necesitan estrategias de diseño no racionales como la mutagenesis aleatoria para aumentar la diversidad genética y fenotípica, acelerando así la evolución de las cepas en el laboratorio [49].

Los sistemas de chasis de plantas, que están más estrechamente alinecon los huéspedes naturales de los productos en términos de expresión de proteínas, modificación post-translacional, y el ambiente catalítico, han ganado una creciente atención de los investigadores en los últimos años. Actualmente, los investigadores pueden usar el tabaco, el tomate y el arroz como células de chasis para producir carotenoides como el licopeno [50]. Por ejemplo, el profesor Liu Yaoguang's Team introdujo la vía de síntesis de carotenoides en el endospermo del arroz, resultando en una nueva variedad de arroz rica en varios carotenoides [51]. Además, Chlamydomonas reinhardtii y Synechocystis, que poseen vías naturales de síntesis de carotenoides, también son células de chasis de plantas ideales [52].

3.2 montaje Modular y adaptación de la vía de síntesis de carotenoides

La construcción de fábricas de células carotenoides implica el montaje de múltiples módulos, así como la combinación y adaptación de factores tales como el rendimiento catalítico y los niveles de expresión entre los módulos de la vía. El objetivo final es maximizar el flujo metabólico del sustral al producto objetivo, al tiempo que se minimiza la acumulación de subproductos no esenciales e intermediarios metabólicos [53]. Las enzimas que limitan la velocidad en la síntesis de carotenoides incluyen CrtE, CrtI, CrtZ y CrtW, que exhiuna especificidad de sustrrelativamente amplia y pueden catalizar múltiples reacciones consecutivas. Sin embargo, las enzimas que limitan la velocidad de las diferentes fuentes pueden requerir diferentes números de pasos de reacción cuando catalizan reacciones consecutivas, afectando significativamente la proporción del compuesto objetivo en el contenido total de carotenoides [54]. Adicionalmente, las diferencias en la selectividad del sustrentre los componentes catalíticos pueden afectar las tasas de conversión de los intermediarios metabólicos [55]. Por lo tanto, el cribado y la combinación de componentes catalíticos de diferentes fuentes es una estrategia eficaz para mejorar el flujo de síntesis de carotenoides y reducir la acumulación de intermediarios metabólicos [56].

Además, el ajuste de los niveles de expresión del módulo también puede mejorar el flujo metabólico general y debilitar los pasos que limitan la velocidad [57]. Al modular la intensidad de expresión del módulo, factores como la fuerza del promotor, el número de copias y la posición de integración del módulo en el cromosoma pueden ser alterados. Típicamente, los módulos pueden ser clonados en diferentes plásmidos para la expresión, facilitando el rápido establecimiento de bibliotecas de expresión con diversas intensidades de expresión y permitiendo el ajuste de niveles de expresión para diferentes módulos. Además, mediante la combinación de diferentes fuerzas del promotor y ajustel origen de replicación del plásmido, la diversidad de la biblioteca se puede aumentar, y el rango dinámico de intensidad de expresión del módulo se puede ampliar [58]. Para lograr una expresión estable de los módulos de genes de la vía de síntesis de carotenoides, se puede adoptar el enfoque de integración del genoma del chasis. La posición de inserción y el número de copia de los módulos de expresión en el cromosoma influyen significativamente en el nivel de expresión general de los módulos y el flujo de la vía de síntesis de carotenoides.

En la construcción de fábricas de células de carotenoides, para lograr una compatibilidad óptima entre los módulos, es necesario detectar diversos factores tales como el rendimiento catalítico de los elementos catalíticos, el número de copias de genes, los niveles de expresión, y la posición de integración y el orden de disposición de los elementos en el cromosoma. Esto requiere la construcción de una biblioteca suficientemente grande para cumplir con la cobertura requerida. La ingeniería metabólica Modular (MME) puede agrupar y agrupar unidades catalíticas involucradas en las rutas metabólicas, tratando cada grupo de unidades catalíticas como un módulo [59]. Este método sólo implica el equilibrio de los niveles de expresión entre los módulos, lo que reduce en gran medida la complejidad de la construcción de la fábrica de células carotenoides.

4 resumen y perspectivas

Los carotenoides, con sus colores vibry sus importantes funciones biológicas, se utilizan ampliamente en la industria farmacéutica, alimentaria y de la salud y tienen un alto valor comercial. En los últimos años, la demanda de carotenoides ha ido en constante aumento. Actualmente, la tecnología de síntesis química total de los carotenoides está madura y sirve como fuente primaria de producción; Sin embargo, su seguridad comestisigue siendo incierta. Por lo tanto, la construcción de fábricas de células sintetizde carotenoipara producir productos relacionados ha ganado una creciente atención. Para maximizar la capacidad de producción de las fábricas de células sintéticas de carotenoides, es necesario optimizar su diseño y regulación. Para abordar eficazmente problemas como el desequilibrio metabólico y la acumulación intermedia, es esencial construir elementos reguladores, diseñar circuitos de genes para regular con precisión los flujos de material y energía, y aprovechar la detección de alto rendimiento, diseño de enzimas, simulación por ordenador, análisis de modelos y elementos de control de genes acoplados.

El continuo desarrollo de las tecnologías de biología sintética ha traído nuevas oportunidades para la construcción de fábricas de células carotenoides. Esto no sólo permite la modularización de los componentes relacionados con la síntesis de carotenoides en la ingeniería, sino que también los dota de características biológicas muy favorables. Esto proporciona más posibilidades para integrar componentes funcionales relevantes para construir sistemas biológicos con funciones biológicas específicas y lograr diseño, desarrollo, modificación y aplicación a gran escala. Las vías metabólicas de síntesis de carotenoides obtenidas de esta manera no sólo muestran una mejor previsibilidad, sino que también simplifican el proceso de modificación y mejoran la eficiencia de la ingeniería metabólica tradicional. Además, el diseño asistido por ordenador y el aprendizaje profundo pueden acelerar y optimizar el diseño de rutas metabólicas y la construcción de procesos. Mediante el aprovechamiento de un continuo diseño, construcción, pruebas y modelo de aprendizaje, se espera alcanzar los efectos deseados del proceso objetivo de antemano, lo que facilitará el desarrollo de fábricas de células sintéticas artificiales más eficientes y estables. La integración interdisciplinde múltiples campos sin duda impulsará la construcción de fábricas de células de síntesis de carotenoides hacia un alto rendimiento, inteligentes y eficientes direcciones.

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