Estudio del método de producción de polvo de licopeno

Licopenes un carotenimportante que pertenece a la familia terpeno de tetraterpenoides. Se encuentra en la naturaleza principalmente en los tomates, productos de tomate, y frutas como sandía y toronja. Es el principal pigmenaen los tomates maduros. El licopenes un fuerte antioxidante con funciones fisiológicas tales como anti-oxid, anti-cáncer y la reducción de lípidos en la sangre. Es ampliamente utilizado en alimentos saludables, medicina, cosméticos y otros campos [1-2]. En la actualidad, el licopense ha utilizado ampliamente como suplemento nutricional y colorante en muchos países [3]. Las ventas acumuladas mundiales de materias primas de licopeno aumentan año tras año y las perspectivas del mercado son amplias.

Producción de polvo de licopenoSe basa principalmente en dos métodos: la extracción de la planta y la síntesis química. El método de extracción de la planta está limitado por la estación, y el largo ciclo de crecimiento de la planta y el bajo contenido de producto no puede garantizar una producción intensiva y a gran escala del producto. El método de síntesis química tiene problemas tales como residuos de reactivos químicos, múltiples formas isomériy contaminación ambiental. El método de síntesis biotecnológica tiene las ventajas de bajo costo, ciclo corto, suministro estable, y el medio ambiente y el desarrollo sostenible. En los últimos años, ha atraído cada vez más la atención de los investigadores.

En la actualidad, la investigación sobre la síntesis biotecnológica de polvo de licopeno ha avanzado considerablemente, como la diversificación de las opciones de las células huéspedmicrobianas, la investigación y la innovación en la ingeniería metabólica para transformar las vías, y la exploración de los procesos de fermentación y las técnicas de amplificación, que han mejorado significativamente el rendimiento del licopeno sintetizpor biotecnología. Senembargo, la mayoría de la investigación todavía se centra en los avances en un solo campo técnico, y ha habido relativamente poca investigación sistemática y resumen de la síntesis biotecnológica de licopeno.

Por lo tanto, este documento revisa las propiedades físicas y químicas del licopeno y las tecnologías de producción actuales, resume sistemáticamente la investigación sobre la biosíntesis de licopeno utilizando la biotecnología representada por la biología sintética, centrándose en la comparación de los métodos de fermentación de diferentes cepas y los métodos precisos de cuantide licopeno, y propone problemas en la producción de licopeno utilizando la biotecnología y las futuras direcciones de investigación, Con el objetivo de servir de referencia para la producción industrial de licopenmediante biotecnología y para la biosíntesis de otros productos naturales de alto valor añadido mediante biotecnología.

1. Las propiedades físicas y químicas y las aplicaciones de polvo de licopeno

El licopeno es un compuesto tetraterpen, un compuesto de alquenil insatury un carotenoide que no contiene átomos de oxígeno. El licopentiene la fórmula molecular C40H56 y una masa molecular relativa de 536,85. Tiene 11 enlaces dobles conjugados y 2 enlaces dobles no conjugen su estructura molecular, y a menudo existe en isómeros cis-trans. En la naturaleza, el licopennatural es principalmente all-trans, con una cantidad muy pequeña de cis.

El polvo de licopeno es un pigmento liposoluble que es insoluble en agua, pero soluble en lípidos y disolventes orgánicos no polares. Su estructura molecular contiene un cromóforo, que corresponde a una región de absorción única en el espectro de absorción ultravioleta visible. La profundidad del color varía de amarillo anaranjado a rojo oscuro dependiendo de la concentración de licopeno, y puede cambiar ligeramente con el solvente. Por ejemplo, los cristales de licopeno disueltos en aceite de girasol aparecen de un rojo oscuro visible, mientras que los disueltos en éter de petróleo aparecen de color amarillo. Debido al número relativamente grande de dobles enlaces en la molécula, el licopeno es muy reactivo y propenso a reacciones de oxide isomeriestructural bajo condiciones de luz, oxígeno y altas temperaturas, lo que puede conducir a una disminución de la actividad fisiológica [4]. Por lo tanto, cuando se extrae el licopeno, con frecuencia se añaden antioxidantes como la vitamina C, la vitamina E, el 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) y la tert-butilhidroquinona (TBHQ) [5].

undiferencia del beta-caroten, el licopenno tiene las propiedades proactivas de la vitamina A, por lo que su aplicación no fue valorada en los primeros días. Senembargo, en los últimos años, a medida que las funciones fisiológicas del licopense han ido conociendo mejor, su aplicación se ha generalizado. El licopenes un poderoso antioxidante que puede eliminar los radicales libres de oxígeno en el cuerpo humano y apagar el oxígeno singlete. Su capacidad antioxidante es cerca de 100 veces la de la vitamina E y el doble de la del betacaroteno [6-9]. También se ha demostrado que tiene antitumoral, previene la enfermedad de próstata y reduce el riesgo de enfermedad cardiovascular [10-11]. Es ampliamente utilizado en cosméticos, productos de salud y alimentos. El licopenha obtenido actualmente la aprobación de la Unión europea como "alimento nuevo" y el estatus de "generalmente reconocido como seguro" (GRAS) en los Estados Unidos. Con la mejora de las personas#39;s los niveles de vida y el creciente énfasis en la salud, los Estados Unidos predice que las ventas de licopencrecerán a una tasa de 35% por año. Por lo tanto, la eficiente tecnología de biosíntesis de licopeno tiene un gran valor de aplicación en el mercado.

2 método de producción de polvo de licopeno

2.1 comparación de los métodos de producción de polvo de licopeno

Actualmente, hay tres métodos para producir licopeno: extracción de plantas, síntesis química y biosíntesis. El método de extracción de plantas consiste principalmente en la extracción y purificación de licopeno de frutos de plantas maduras como los tomates. Sin embargo, este método se ve afectado por varios factores como la región, la estación, la variedad de tomate y la madurez, y por lo tanto es inestable. En China, el licopense extrae principalmente de los tomates cultivados en Xinjiang (con largos días de sol). Sin embargo, el contenido de licopenen los tomates es muy bajo, generalmente solo 20 mg/kg, e incluso en la piel del tomate, donde el contenido es mayor, es inferior a 0,4 g/kg [12].

El costo de extracción es alto, y el extracto a menudo contiene otros carotenoides, lo que afecta a la pureza del producto. Y debido a que el contenido es bajo, el proceso de extracción consume una gran cantidad de disolventes orgánicos, lo que tiene un mayor impacto en la contaminación ambiental. El método de síntesis química involucra principalmente la reacción de Wittig de clorde octatrienedial y trifenilfosfina o sulfurde trifenilfosina para sintetizar licopeno [13]. El método de síntesis química tiene las características de alto rendimiento (más del 65%), materias primas baratas y reciclables, y condiciones de reacción suaves. Aunque el método de síntesis química tiene un alto rendimiento y bajo costo, es propenso al isomerismo debido a los muchos dobles enlaces en la estructura del licopeno, y hay un riesgo para la seguridad ya que el producto puede contener residuos de disolventes. El método de biosíntesis se refiere al proceso en el cual los microorganismos fermentan y producen licopenutilizando materias primas abundantes y fácilmente disponibles como azúcares, jarabe de maíz y sales inorgánicas. El método de fermentación microbiana no sólo tiene la seguridad del método de extracción de la planta (ambos se derivan naturalmente del metabolismo biológico y no se sintetizartificialmente), sino que también tiene las ventajas de bajo costo y la producción a gran escala del método de síntesis química. Se considera un método ideal para la producción futura de licopen.

2.2 vía biosintética del polvo de licopeno

El licopenes un compuesto tetraterpenoide similar a otros terpenoides. Los precursores comunes para su biosíntesis son las dos unidades isopentenilo IPP (pirofosfato de isopentenilo) y DMAPP (pirofosfato de dimetilalilo), que son isómeros el uno del otro [14]. Actualmente, hay dos maneras de sintetizar IPP y DMAPP en la naturaleza: una es la ruta MEP (2-metil-eritritol-4-fosfato) en procariotas y plantas, y la otra es la ruta MVA (mevalon) en eucariotas.

La ruta MEP (2-metil-eritritol-4-fosfato) en procariontes y plantas, y la ruta MVA (mevalonato) en eucariontes.

La vía MEP utiliza piruvato y 3-fosfoglicerato como sustrde partida para sintetizar IPP y DMAPP [15], mientras que la vía MVA utiliza acetil coenzima A como sustrde partida para sintetizar IPP y DMAPP A través de una reacción enzimde siete pasos [16]. En comparación con la vía de la MEP, la vía del MVA se estudió antes y su mecanismo de reacción es más completo. La vía biosintética del licopense puede dividir en dos módulos. El módulo aguas arriba es el proceso de síntesis de las sustancias precursoras IPP y DMAPP, y el módulo aguas abajo es el proceso de síntesis de licopeno de IPP y DMAPP (véase la figura 1 para una visión general). IPP y DMAPP se someten a reacciones de condenspor etapas bajo la acción de isopentenil transferasa para generar GGPP, y luego GGPP (pirofosfato de geranilgeranilo) se convierte en octahidrolicopeno por la acción de octahidrolicopensintasa (fitoeno sintasa, CrtB), y luego a licopenpor la acción de octahidrolicopendeshidrogenasa (fitoeno desaturasa, CrtI).

2.3 microorganismos que sintetizan licopeno

Los microorganismos actualmente conocidos que fermentan para producirLi;;;;;;;;;;;;;;;;;Incluyen: la pantoea que puede sintetizar el licopenen sí mismo, Blakeslea trispora, y la levadura metabolicamente diseñada, Yarrowia lipolytica, y Escherichiacoli. Entre ellas, Blakeslea trispora ha sido más estudiada [17] y es también la única cepa que puede lograr la producción industrial de − -caroteno. El licopeno, un producto intermedio en la síntesis de − -caroteno, se puede acumular añadiendo un inhibidor de la ciclasde de licopendurante el proceso de fermentación. Varios estudios han mostrado que la producción de licopenpor Blakeslea trispora ha mejorado continuamente, y la producción de licopenmás alta notificada es de 3,4 g/L [18]. Sin embargo, el mode tricoteceno es propenso a degeneración durante el subcultivo, resultando en rendimientos inestables. Además, el largo ciclo de crecimiento lo hace menos productivo, y la necesidad de agregar inhibidores durante la producción también limita enormemente el proceso de fermentación del licopencon momotricoteceno [19].

3 investigación sobre la síntesis biotecnológica del licopeno

3.1 modificación de ingeniería de los principales microorganismos para la síntesis de licopeno

Escherichia coli es uno de los huéspedes microbimás utilizados para la síntesis heteróloga de terpenoides. Ventajas tales como un fondo genético claro, crecimiento celular rápido, y una gran cantidad de herramientas de manipulación genética hacen de E. coli una plataforma huésped ideal para el desarrollo de productos industriales. Algunos estudiosos han diseñado con éxito E. coli para la producción heteróloga de carotenoides de alto rendimiento a través de ingeniería metabólica y técnicas de biología sintética [20-21]. Sin embargo, debido a los riesgos de que E. coli sea susceptible a la infección por fagos y a la presencia de endotoxinas [22], el uso de E. coli para producir licopenactualmente plantea ciertos riesgos para la inocuidad de los alimentos y, por lo tanto, su aplicación industrial es limitada.

Saccharomycescerevisiaees un organismo modelo eucariótico cuyo genoma ha sido secuenciado, cuya biología celular ha sido bien caracterizada, y para el cual existen herramientas y métodos de manipulación genética maduros. No hay riesgo de contaminación por fagos durante la fermentación a gran escala de Saccharomycescerevisiae, y generalmente se considera más segura que la Escherichia coli. Por lo tanto, se considera que el uso de la ingeniería metabólica para transformar Saccharomyces cerevisiaepara la producción heteróloga de licopeno tiene grandes perspectivas de aplicación. Al igual que la Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiaeno puede sintetizar carotenoides por sí sola y debe introducir los genes de síntesis pertinentes [23-26].

Yarrowia lipolytica es un huésped microbino convencional que produce grandes cantidades de lípidos y se considera seguro. Aunque no puede sintetizar carotenoides directamente, puede producir grandes cantidades del precursor acetilcoenzima A, y la síntesis de carotenoides se puede lograr mediante la introducción de enzimas clave exógenas. Los investigadores han desarrollado muchas herramientas genéticas para diseñar la levadura Lipomyces, que se considera un huésped prometedor para la producción de carotenoides a través de la vía MVA [27-28].

Las microalgas eucariotas, como microorganismos autótrofos, pueden utilizar energía de la luz y dióxido de carbono para producir biomasa, y por lo tanto tienen un gran potencial metabólico para la producción sostenible de terpenoides. Sin embargo, la investigación actual sobre la ingeniería metabólica de algas de alto nivel está muy por detrás de la de otros huéspedes, lo que en cierta medida limita su aplicación [29].

La levadura roja Rhodosporidium toruloides puede producir pigmentos como − -caroteno y − -carotena través de la biosíntesis intracelular. Los investigadores han mejorado su capacidad de producción de carotenoides mediante la optimización de las condiciones de cultivo y mutagenesis. Sin embargo, actualmente hay una investigación muy limitada sobre la levadura roja, posiblemente debido a las limitaciones de los datos genómicos disponibles y la falta de anotación funcional de genes clave, lo que ha obstaculizen gran medida la ingeniería metabólica de carotenoides de alto rendimiento [30]. Otras levaduras no carotenogénicas, como la Pichia pastoris, que puede crecer a altas densidades sin acumulación de etanol, también han sido diseñadas para sintetizar carotenoides, pero los rendimientos son bajos y necesitan ser estudiados [31].

3.2 estrategias para la ingeniería de microorganismos para sintetizar licopeno

1) mejora del módulo Upstream (suministro de precursores IPP/DMAPP)

Para lograr altos rendimientos de carotenoides como el licopeno, el aumento de la síntesis de los precursores generales IPP y DMAPP es una estrategia eficaz. La síntesis de IPP y DMAPP involucra dos vías naturales, la vía MEP y la vía MVA. (a) la vía MEP se encuentra principalmente en procariotas. DXSe IDI son generalmente considerados como las principales enzimas que limitan la velocidad en esta vía, y han sido sobreexpresados para mejorar la síntesis de isoprenoides [32]. Li et al. [33] encontraron que IspA, ispH e ispE aumentaron aún más el flujo de la vía en las cepas sobreexpresadas DXS e IDI. La sobreexpresión de ispG puede efectivamente reducir el flujo de salida de MEC en la célula, resultando en un aumento significativo en la producción de isoprenoides aguas abajo [34]. Con base en esto, Li et al. [35] lograron aumentar la producción de licopenen 77% al activar el gbpe y el hbpe para eliminar la acumulación de intermediarios de PEM. (b) la vía del MVA se encuentra principalmente en eucariotas. La HMG-CoA reductasa es el primer paso en la biosíntesis de compuestos isoprenoides a través de la vía MVA [36]. La sobreexpresión de la región catalítica de la HMG-CoA reductasa (tHMG1) en Saccharomyces cerevisiae puede aumentar la producción de licopeno [24]. Además, aunque se ha avanzado en la producción de carotenoides mediante la optimización de la vía MEP, los mecanismos reguladores de los huéspedes naturales en la vía MEP limitan su aplicación [37]. Con el fin de evitar esta vía, Zhu Fayin et al. [20] introdujeron la vía MVA completa y genes exógenos en Escherichia coli y obtuvieron un rendimiento de licopende de 1,44 g/L mediante la alimentación por lotes y la optimización de la fermentación.

(2) Investigación sobre los módulos descendentes (la vía de síntesis heteróloga de licopen). Una estrategia común es introducir genes de la vía heteróloga en huéspedes no carotenoides para producir carotenoides, convirtiendo los precursores de la síntesis de terpenipp y DMAPP en carotenoides. Verwaal et al. [38] expresaron un plásmido en E. coli que contenía genes que codifican la geranilgeranilo pirofosfato sintasa y la octahidrolicopensintasa, así como cDNA que codifica la licopendesaturasa y, en última instancia, observaron la acumulación de licopen. La introducción de copias de CrtI y tHMG1 en células de levadura sintetizde carotenoiaumentó el contenido de beta-caroten. Con el fin de lograr una expresión de alto nivel y genéticamente estable de los genes de la vía heteróloga, Tyo et al. [39] establecieron un sistema de expresión de alta copia genética libre de plasdos para la evolución cromosómica induquímicamente, que se utilizó en la ingeniería de E. coli y, en última instancia, aumentó la producción de licopenen un 60% en comparación con el sistema de expresión de plásmidos. Los estudios han demostrado que la optimización de la vía de síntesis de licopenes muy importante para el licopende heterde alto rendimiento.

3) regulación descendente de la vía de deriv.

4) el precursor de la síntesis de licopen, FPP, es también un precursor común de muchos metabolide levadura (tales como ubiquinona, alcohoterpénicos, squalene, etc.). Sin embargo, el knockdirecto de estos genes precursores de la vía competitiva (como el gen de síntesis de squalene) tendrá un gran impacto en el crecimiento celular. Por lo tanto, muchos académicos se han comprometido a reducir la regulación de estas vías competitivas para mejorar el flujo de síntesis de licopeno. La sustitución de un promotor débil para el promotor natural para reducir la regulación de la competencia squalene sintasa del gen sqs1 puede aumentar el rendimiento valorable de − -carotende (453.9 − 20.2) mg/L a (797.1 − 57.2) mg/L en Yarrowia lipolytica [40]. Xie Wenping et al. [41] usaron el promotor de inducción alta de glucosa/represión baja de glucosa pHXT1 control en Saccharomyces cerevisiae para lograr la expresión secuencial del gen erg9 y los genes de la vía de los carotenoides en respuesta a los cambios en la concentración de glucosa en el cultivo, lo que resultó en un aumento significativo de la producción de licopeno en la levadura. Hong et al. [42] eliminaron los genes dpp1 y lpp1 en Saccharomyces cerevisiae para suprimir la vía que compiten por la producción de farnesol, y suprimila producción de ergosterol mediante la regulación de la expresión erg9, que también aumentó la producción de licopeno. Los estudios anteriores han demostrado plenamente que la regulación negativa de las vías competidoras es una estrategia eficaz para aumentar la producción de licopeno.

4) transformación de la célula del chasis

Además de optimizar la vía de síntesis heteróloga del licopeno, también se requiere la transformación de la célula del chasis del huésped para que coincida con la vía heteróloga. La modificación de la célula del chasis incluye: la mejora del flujo de precursores de acetil-CoA [43], el fortalecimiento del suministro de cofactores como el ATP y NADPH, la eliminación de ciertos genes no esenciales, y la evolución adaptativa de la cepa. El acetil-CoA es el sustrpara la biosíntesis de carotenoides. Chen Yan et al. [24] estudiaron en detalle el mecanismo de acción del gen ypl062w en Saccharomyces cerevisiae. La eliminación de ypl062w puede mejorar el flujo de acetil coenzima A y, en última instancia, aumentar la producción de licopen, hasta 1,65 g/L. Zhou et al. [26] usaron la evolución adaptativa de Saccharomyces cerevisiae combinada con técnicas de ingeniería metabólica para lograr un rendimiento de fermentación con lotes de 8,15 g/L de licopeno. El suministro de ATP como energía y NADPH como poder reduces es un factor importante que afecta la síntesis de carotenoides. Mediante la modificación de los módulos metabólicos centrales para la asimilación de la fuente de carbono (EMP y vías PPP), el suministro de ATP y NADPH se mejoró, y la ingeniería de E. coli podría sintetizar 2,1 g/L − -caroteno en la fermentación por lotes [44]. Modular la expresión de los genes sucAB y sdhABCD puede aumentar el flujo de carbono del ciclo del ATC y aumentar el suministro de ATP. Además, la modulación del gen talB puede aumentar el suministro de NADPH, lo que aumenta el rendimiento de la síntesis de licopenpor E. coli a 3,52 g/L [45].

(5) Ingeniería metabólica sistemática de Saccharomyces cerevisiae para producir licopende alto rendimiento. En las figuras 2 y 3 se presenta un resumen.

Shi Bin et al. [25] diseñaron sistemáticamente Saccharomyces cerevisiae para biosintetizar licopeno de manera eficiente mediante ingeniería metabólica y enumeraron cuatro cuestiones clave: (a) es necesario equilibrar la acumulación de metabolisecundarios y el crecimiento de las células huésped; (b) la vía de síntesis heteróloga de licopeno debe mejorarse en la levadura; (C) las células de chasis de levadura necesitan ser modificadas para proporcionar más sustancias precursoras y reducir la potencia; (d) es preciso optimizar la tecnología de fermentación de la levadura. (a) la selección de un grupo de promotores GAL que puedan controlar razonablemente la vía de síntesis heteróloga del licopeno, separando el crecimiento de las células de levadura de la acumulación del producto licopeno en términos de secuencia de tiempo, y la fuerza del promotor también es comparable a la del promotor fuerte constitutivo durante el período de síntesis del producto; B) realizar un examen exhaustivo de las tres fuentes genéticas clave de la vía de síntesis heteróloga de licopenpara obtener una nueva combinación óptima de PaCrtE, PagCrtB y BtCrtI que funcione de manera eficiente en Saccharomyces cerevisiae. (C) también se llevaron A cabo una serie de modificaciones en las células del chasis de Saccharomyces cerevisiae para proporcionar suficientes precursores para la síntesis de licopeno, la coenzima acetilo A y el poder reducnadph (coenzima II reducida), y eliminar ciertos genes endógenos no esenciales que afectan la acumulación de licopeno para aumentar aún más la producción de licopeno; (d) a través de estos sistemas métodos de ingeniería metabólica, combinados con la transformación de los procesos de fermentación de Saccharomyces cerevisiae para biosintetizar licopeno de manera eficiente.

Enumeró cuatro cuestiones clave: (a) la acumulación de metabolisecundarios y el crecimiento de las células huésped deben ser equilibrados; (b) la vía de síntesis heteróloga de licopendebe mejorarse en la levadura; (C) las células de chasis de levadura necesitan ser modificadas para proporcionar más sustancias precursoras y reducir la potencia; (d) es necesario optimizar la tecnología de fermentación de levaduras. (a) la selección de un grupo de promotores GAL que puedan controlar razonablemente la vía de síntesis heteróloga del licopeno, separando el crecimiento de las células de levadura de la acumulación del producto licopeno en términos de secuencia de tiempo, y la fuerza del promotor también es comparable a la del promotor fuerte constitutivo durante el período de síntesis del producto; B) realizar un examen exhaustivo de las tres fuentes genéticas clave de la vía de síntesis heteróloga de licopenpara obtener una nueva combinación óptima de PaCrtE, PagCrtB y BtCrtI que funcione de manera eficiente en Saccharomyces cerevisiae. (C) también se llevaron A cabo una serie de modificaciones en las células del chasis de Saccharomyces cerevisiae para proporcionar suficientes precursores para la síntesis de licopeno, como la acetila coenzima A y el poder reducnadph (coenzima II reducida), y eliminar ciertos genes endógenos no esenciales que afectan la acumulación de licopeno para aumentar aún más la producción de licopeno; (d) a través de estos sistemas, métodos de ingeniería metabólica, combinados con la optimización de la fermentación de medios sintéticos por Saccharomyces cerevisiae, el rendimiento de licopenfue tan alto como 3,28 g/L, que inicialmente alcanzó el nivel industrial. En la actualidad, la escala de la fermentación al estilo chino se ha ampliado con éxito hasta 6.000 L. además, la estrategia de ingeniería metabólica desarrollada para Saccharomyces cerevisiae también se ha ampliado con éxito a la síntesis biotecnológica de otros compuestos de terpen, como el -farneseno [46], bergapten [47], y otros sesquiterpencomo el -cariofilleno. Entre ellos, Deng Xiaomin et al. [47] utilizaron esta estrategia de ingeniería de sistemas para aumentar el rendimiento de bergaptproducido por la ingeniería metabólica de cepas de Saccharomyces cerevisiae a 34,6 g/L.

3.3 proceso de fermentación de bacterias manipuladas con licopeno

En la actualidad, la investigación sobre la fermentación de licopende de alto rendimiento por microorganismos también ha avanzado mucho. Las materias primas de fermentación, los procesos y las escalas utilizadas por las diferentes cepas serán diferentes (se resumen en la tabla 1).la matriz de sustrutilizada en el proceso de fermentación varía con el tipo de microorganismo. Los huéspedes de fermentación con una síntesis heteróloga de licopenmás madura son generalmente Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. En general, la fermentación de Escherichia coli utiliza glicercomo fuente de carbono [20,45], mientras que Saccharomyces cerevisiae utiliza principalmente glucosa como fuente de carbono [23-26].

Zhu Fayin et al. [20] utilizaron glicercomo fuente de carbono para la ingeniería de Escherichia coli y obtuvieron un rendimiento de licopende de 1,44 g/L utilizando un medio totalmente sintético en un fermentde 5 L. La escala de fermentación se amplió posteriormente a 150 L, produciendo 1,32 g/L, lo que indica que la cepa puede ampliarse para la producción. Sun et al. [45] usaron la ingeniería de E. coli para fermentar en un fermentador de 7 L con glicercomo fuente de carbono en la alimentación por lotes, y finalmente obtuvieron 3,52 g/L de licopeno. Chen Yan et al. [24] utilizaron Saccharomyces cerevisiae para fermentar glucosa y etanol como fuentes de carbono y extracto de levadura y peptona como fuentes de nitrógeno en un fermentador de 5 L utilizando alimentación por lotes.

Obtuvieron un título de licopende 1,65 g/L. Shi Bin et al. [25] usaron Saccharomyces cerevisiae diseñado para llevar a cabo la fermentación de dos etapas por lotes en un fermentde 7 L usando glucosa y etanol como fuentes de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. Los residuos de glucosa y etanol en el caldo de fermentación se controlarestrictamente y se obtuvo un título final de licopende 3,28 g/L. Dado que Saccharomyces cerevisiae tiene muchas ventajas sobre Escherichia coli, como la alta seguridad alimentaria y la resistencia a la infección por fagos, la investigación sobre la fermentación de licopenpor Saccharomyces cerevisiae es más prometedora. En la actualidad, los medios YPD naturales, que a menudo utilizan peptona y extracto de levadura como fuentes de nitrógeno para la fermentación de la levadura [24,26], así como medios semisintéticos con sulfato de amonio, extracto de levadura y peptona como fuentes de nitrógeno mixtas [23], y medios totalmente sintéticos con sulfato de amonamonio como fuente de nitrógeno [25]. El medio filtrtotalmente sintético tiene la ventaja de ser barato, fácil de fermentar repetidamente y escalar, y tener una composición clara que es conveniente para su posterior optimización. En el futuro, se deben realizar más investigaciones sobre la fermentación de los medios de levadura sintética para hacer que la producción de licopensea alta y estable, repetible y escalable, sentando una base sólida para aplicaciones industriales posteriores.

3.4 extracción y cuantidel licopensintetizpor microorganismos

Los carotenoides como el licopentienen fuertes propiedades antioxidantes, y el riesgo de oxide isomeridebe ser minimidurante el proceso de extracción [49]. Por ejemplo, algunos estudios han elegido operar bajo condiciones de protección contra la luz [20,45], o agregar el antioxidante BHT al agente de extracción [24-25,27]. Los disolventes de extracción comúnmente utilizados son acetona, éter de petróleo, cloroform, hexano, acetato de etilo, etc. [49]. Dado que el licopenes un producto intracelular, es necesario interrumpir la pared celular, y el método de interrupción de la pared celular varía dependiendo del espesor de la pared celular huésped. Por ejemplo, la pared celular de Escherichia coli es relativamente delgada, generalmente se usa la resuspende acetona, seguida de destrucción de la pared celular en un baño de agua de 55 °C [20,45]; Los organismos eucariotas tales como la levadura soluble en lípidos y Saccharomyces cerevisiae tienen paredes celulares más gruesas, y las cuentas de vidrio y los reactivos de extracción se añaden generalmente para romper las células sacudiendo [25,27]; La pared celular de levadura también se puede romper hirviéndola en un baño de agua con ácido clorhídrico [23-24].

Los métodos utilizados para detectar y cuantificar carotenoides como el licopentambién varían en los estudios existentes. La mayoría de los estudios utilizan cromatolíquida de alto rendimiento (HPLC) para detectar carotenoides como el licopeno y el beta-caroten[23-26,45], mientras que algunos utilizan espectrofotometría ultraviole[20,27]. Debido a que la detección de uv-espectrofotómetro es interferpor impurezas con la misma longitud de onda de absorción, y el método HPLC detecta primero separando diferentes sustancias y luego detectando el valor de absorción. En términos relativos, la cuantiprecisa de carotenoides como el licopeno mediante HPLC es más precisa, mientras que la detección por espectrofotómetro UV puede utilizarse como un medio complementario para evaluar inicialmente la tendencia de los cambios en el rendimiento durante la fermentación.

En la mayoría de los estudios se utilizó una curva estándar con las normas correspondientes de licopeny → -caroteno para calcular el rendimiento [23-26,45], pero no se indicó si se calibrlas normas de licopen/ → -caroteno compradas. Sólo unos pocos investigadores declararon explícitamente que la concentración de la solución estándar había sido calibrantes antes de dibujar la curva estándar [25]. La razón por la que se debe calibrar la concentración de la solución estándar preparada es que es difícil pesar con precisión una pequeña cantidad de licopeno o − -caroteno estándar, y no es fácil determinar con precisión si los cristales de licopeno en el disolvente orgánico se han disuelto por completo. Además, la pureza del estándar adquirido también puede cambiar debido a los métodos de almacenamiento y el tiempo. Estos factores objetivos pueden causar grandes errores en el trazado de la curva estándar de licopen, lo que hace que el rendimiento calculado no sea muy preciso. Con el fin de eliminar la interferencia de los factores anteriores, el método común es utilizar primero un espectrofotómetro para medir la absorbancia del licopenpreparado y otra solución estándar de carotenoides, y luego calcular el contenido absoluto de los carotenoides en la solución de acuerdo con el coeficiente de extinción correspondiente [25,50-51]. Este método puede eliminar los errores causados por un peso inexacto o la disolución incompleta de la muestra. En resumen, se utiliza HPLC para detectar licopencon precisión en la muestra y se traza una curva estándar con una solución estándar calibrada, y los resultados cuantitativos serán más precisos.

4 conclusión y perspectivas

El licopen, como un fuerte antioxidante, tiene muchas buenas funciones fisiológicas y tiene una amplia perspectiva de mercado. Este documento proporciona una revisión detallada de las propiedades fisicoquímicas, funciones fisiológicas y métodos de producción del licopeno, y se centra en resumir el progreso actual de la investigación en la producción de licopenpor biotecnología, incluyendo la selección de la diversidad de las células huésped microbianas, las últimas estrategias de ingeniería metabólica, métodos de fermentación y extracción de licopeny métodos de cuantiprecisa.

Aunque se ha hecho algún progreso en la síntesis biotecnológica de licopeno, todavía hay muchos problemas con el proceso de biosíntesis de licopenporque es un proyecto de investigación de ingeniería compleja con muchos factores que influyen. A continuación se resumen las orientaciones de investigación pertinentes para el futuro:

(1) Ampliación y replicestable de la producción de fermentación. En la actualidad, la mayor parte de la investigación sobre la síntesis biotecnológica de licopeno se encuentra todavía en la etapa de laboratorio de experimentos en tanques de fermentación a pequeña escala, mientras que la investigación industrial se basa a menudo en la producción de fermentación a gran escala calculada en toneladas o decenas de toneladas. La fermentación a gran escala desde la producción a pequeña escala hasta la producción piloto no es simplemente un aumento lineal en el volumen del tanque, sino que también implica muchos desafíos como la transferencia de calor desigual, la transferencia de masa y la transferencia de oxígeno, así como cambios en el modelo de crecimiento de la cepa. Según el author's experiencia práctica, durante el proceso de amplificación de fermentación de cepas modificadas, pueden ocurrir problemas como envejecimiento prematuro de cepas, degradación del fenotipo de cepas, cambios en las estrategias de alimentación, y rendimientos de fermentación inestables. Los investigadores necesitan ajustar individualmente los parámetros y condiciones de la amplificación del proceso de fermentación. La investigación futura sobre la amplificación de la escala de producción de fermentación es la clave para resolver el problema de la producción industrial de licopeno mediante la biotecnología.

(2) proceso de extracción y purificación de licopeno de fuentes microbianas. El licopeno es un producto intracelular, y el proceso de extracción y purificación implica muchas etapas, tales como la ruptura celular, la eliminación de impurezas, y la cristalización de licopeno. Durante este proceso, el licopense oxida fácilmente, lo que lleva a cambios estructurales. Por lo tanto, la tasa de extracción es difícil de asegurar y es necesario investigar en profundidad el proceso de extracción y purificación de licopeno de fuentes microbianas.

(3) investigación sobre ensayos de calidad del licopeno microbiano. Aunque el licopenmicrobiano es también un producto de la catálisis enzim, no se deriva de los tomates naturales y puede implicar cuestiones como la modificación genética. Por lo tanto, el licopenmicrobiprimero debe ser identificado estructuralmente para asegurar que es consistente con las fuentes naturales de tomate, y luego se requiere una prueba de calidad de productos tales como residuos de metales pesados y contenido microbi. Asegurar la estructura y calidad del producto es también un factor importante que afecta la aplicación de licopenmicrobien el mercado.

(4) control de costos de producción: para competir en el mercado con el licopenextraído naturalmente, el licopensintetizbiotecnológicamente debe tener una ventaja de costo significativa. Los principales costos de la fermentación biológica para producir licopeno incluyen materias primas para la fermentación, deprecidel equipo, extracción y purificación, mano de obra y comercialización. Al diseñar y optimizar las condiciones del proceso de producción se deben tener en cuenta los factores de costo, como el uso de medios de fermentación totalmente sintéticos más baratos, la distribución de los costos mediante la ampliación de la fermentación y el uso de métodos más avanzados, como la interrupción enzimde las células para extraer licopeno para reducir los costos de producción.

Resolver estos problemas es de gran importancia teórica y práctica para promover la industrialización de la producción de licopeno por biotecnología, y también puede servir de referencia para la investigación sobre la producción biotecnológica de otros productos naturales de alto valor añadido.

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