Estudio sobre glutatión a partir de extracto de levadura

Un gran número de estudios han demostrado que la actividad fisiológica del glutatión es de gran valor para las personas#39 y vida, y ha desempeñado un papel importante en diversos campos como la alimentación, la medicina y los productos sanitarios. En la actualidad, el método más comúnmente utilizado para la producción industrial de glutatión es el método de fermentación de cepa pura, y las cepas utilizadas son principalmente Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli. Las cepas de fermentación de pura raza tienen requisitos relativamente estrictos en las condiciones ambientales, y el tiempo de fermentación es relativamente largo. En el proceso de optimización de la fermentación para aumentar el contenido de glutatión, el aumento en el rendimiento de glutatión se basa en las condiciones de las propias cepas, por lo que con el fin de obtener un mayor rendimiento de glutatión, es necesario trabajar en la selección de cepas con alto rendimiento, y mejorar la capacidad de las cepas para sintetizar el glutatión a través de ciertos medios tecnológicos (mejoramiento de mutaciones y cruzamientos de ingeniería genética, etc.). Mediante ciertos medios técnicos (selección por mutación, hibrigenética, etc.), puede mejorarse la capacidad de síntesis del glutatión de la cepa. Este método ha sido ampliamente utilizado en la producción industrial.

Brewer's la levadura es muy rica en nutrientes, y se ha determinado que contiene una gran cantidad de proteínas, aminoácidos esenciales, y una pequeña cantidad de unRN, y la pared celular de las células de levadura contiene 25%-35% de polisacáridos de levadura, principalmente glucanos y mananos [87]. En los últimos años, con el rápido desarrollo de China&#En la industria cervecera, la producción de cerveza ha aumentado año tras año. De los últimos datos, China&#La producción de cerveza de 39;s será de alrededor de 30-40 millones de toneladas de 2016 a 2021, y la producción anual de cerveza está muy por delante de otros países, y cada 200 t de cerveza puede producir 3,0 t de brewer&#Lodos de levadura de 39;s con un contenido de agua de alrededor del 80%.

El propósito de este experimento es biosintetizar el glutatión directamente de la levadura de cerveza fresca después de la producción de cerveza desde la perspectiva de la economía y la protección del medio ambiente. La ventaja de este experimento es utilizar las células residuales de levadura de cerveza después de la fermentación, y añadir una gran cantidad de levadura fresca fisiológicamente activa directamente en el proceso de producción de glutatión sin necesidad de precultivo de levadura, que no sólo acorta el ciclo de producción y ahorra energía, sino que también hace que la levadura de cerveza sea más barata y más abundante. Este método no requiere estrictas condiciones de cultivo, y la síntesis de glutatión puede llevarse a cabo con suficientes materias primas en las condiciones de menor tiempo y bajo costo, lo que no sólo puede crear más beneficios económicos para los fabricantes de cerveza y realizar el uso eficaz de los recursos, sino también resolver los problemas de desperdide recursos y la contaminación ambiental, que es de importantes efectos económicos y sociales.

1. introducción

La producción deGlutatión por fermentación de levaduraSe ha estudiado en el país y en el extranjero, y el método de fermentación tiene ventajas obvias, y las cepas utilizadas para la producción de glutatión son principalmente bacterias o células de levadura. Estas células son fáciles de cultivar, fáciles de manejar, y las condiciones de reacción son leves. Por lo tanto, la fermentación se ha convertido en el método más comúnmente utilizado para la producción de glutatión.

La optimización del brewer&#El proceso de cultivo de levadura 39;s se centra en las condiciones nutricionales y los factores ambientales de la fermentación del glutatión, incluyendo la influencia de las fuentes de nitrógeno y carbono, las concentraciones de iones metálicos y los aminoácidos precursores en la síntesis de glutatión por las células.

No hay muchos informes sobre la síntesis directa de glutatión De fresh brewer's levadura después de la fermentación. En este capítulo, los efectos de los componentes de cultivo, condiciones de cultivo y estrategias de adición de aminoácidos precursores en la síntesis de glutatión por brewer&#La levadura 39;s fue investigada para encontrar las condiciones óptimas de biosíntesis y las estrategias de adición de aminoácidos a través de experimentos de optimización unidireccional y experimentos de análisis de superficie de respuesta con el fin de mejorar la producción de glutatión.

2. experimento

2.1 materiales experimentales

Brewer&#La levadura 39;s fue proporcionada por Yantai Muping Brewery (levadura fresca de la fábrica de cerveza después de la producción de cerveza). Desde the fresh brewer's la levadura tiene una vida útil limitada y es propenso a perder su actividad fisiológica si se deja durante mucho tiempo, los experimentos a largo plazo necesitan utilizar diferentes lotes de brewer&#Con el fin de minimizar los errores experimentales y garantizar la precisión de los datos, hemos tratado de garantizar que el mismo lote de levadura de cerveza se utiliza bajo los mismos factores y niveles. Con el fin de minimizar los errores experimentales y garantizar la precisión de los datos, hacemos todo lo posible para utilizar el mismo lote de brewer's para los experimentos con los mismos factores y niveles.

2.2 materiales y reactivos

Tabla 2. 1 materiales y reactivos

2.3 instrumentos y equipos principales

Cuadro 2.2 instrumentos y equipos

2.3 elementos básicos

Medio del frasco agit: 25 g/L de glucosa, 10 g/L de peptona, 1.0 g/L K2HPO4, 1.0 g/L KH2PO4, 0.3 g/L CaCl2, 2.5 g/L MgSO4, 0.05 g/L FeSO4.

La composición del pre-medio es como arriba, y el post-medio tendrá algunos ajustes en el proceso de la optimización.

2.4 condiciones de cultivo

Una cierta cantidad de brewer& pre-tratado#Se añadió lodo de levadura 39;s en un frasco cónico, y se mezcla fondo de acuerdo con la relación del 20% del volumen de lodo de levadura en relación con el volumen de medio para disolver el lodo de levadura. El tiempo de fermentación fue de 24 h, la temperatura de fermentación fue de 28℃, la velocidad de agitación fue de 160 RPM, y el volumen de líquido fue de 24 mL/300 mL. Las muestras se tomaron a intervalos de 3.0 h. La biomasa celular, el glutatión total y el contenido intracse determinaron en tres conjuntos de experimentos paralelos.

2.5 métodos de medición

2.5.1 Brewer's tratamiento previo de levadura

Pre-tratamiento del purín de levadura de cerveza fresca: en el purín de levadura de cerveza fresca de la fábrica de cerveza Muping, añadir el doble del volumen de agua desionizada y remover y enjuagar 4~5 veces, cuando el purín de levadura se asiente, descartar el sobrenadante y la materia flotante, enjuagar repetidamente hasta que la capa superior del líquido se vuelva incolora y clara de amarillo, y luego descartar el sobrendespués de lo suficientemente estático y obtener el puren 4.0℃ refrigerpara ser utilizado.

Brewer's pretratamiento de células de levadura para la determinación de glutatión: tomar 5,0 mL de caldo de fermentación de brewer's células de levadura y ponerlo en un tubo de centrifu, centrifua 4500 RPM, descartar el sobrenadante, añadir 40% solución de etanol, extracto de 2,0 ha 40℃, centrifua 5000 RPM, y tomar el sobrenadante y diluirlo durante un cierto número de veces, que se utilizarán como las muestras para la determinación de glutatión.

2.5.2 determinación de biomasa celular de Brewer's levaduras

Brewer&#Los organismos de levadura 39;s obtenidos por centrifuy el tubo de centrifufueron secados en un horno a 80°C a un peso constante y pesados con precisión, y el peso total del brewer&#Los organismos de levadura 39;s y el tubo centrífugo fueron pesados como (w1). A continuación, el brewer& seco#39;s organismos de levadura en el tubo de centrífuga fueron lavados, y el tubo de centrífuga se secó a un peso constante, y el peso del tubo de centrífuga se pescomo (w0), y el peso total del tubo de centrífuga se pescomo (w0). W (g)=w1-w0.

2.5.3 métodos para la determinación del glutatión

Método de tetroxidina [64]: tomar 1,0 mL de la solución de la muestra a ensayar, añadir 0,5 mL de ácido glicólico 0,1 mol/L, 3,5 mL de solución amortigude 0,24 mol/L de fosfato y 1,0 mL de 1,0 g/L de solución de tetroxidina para reaccionar completamente durante 20 min, y luego se midió el valor de absorvancia de A305 por espectrofotómetro ultravioleta A305 nm.

2.6 métodos experimentales

2.6.1 determinación del tiempo de fermentación de la levadura de cerveza

El pretratado brewer&#El lodo de levadura 39;s se mezclcon el medio a un volumen del 20% y se añadió a los frasagita a un volumen del 8%. La fermentación se incubó continuamente durante 30 h a una temperatura de 28℃ y una velocidad de rotación de 160 RPM. El glutatión total, el contenido intracy la biomasa celular de la levadura se midieron tomando 5,0 mL del caldo de fermentación de levadura cada 3 horas. Se crearon tres grupos de experimentos paralelos.

2.6.2 principales condiciones de cultivo y efecto de la composición de nutrientes

2.6.2.1 efecto del volumen de carga sobre el glutatión sintetiz.

En este experimento, 300 mL de frasbatidos fueron llencon 6%, 8%, 10%, 12% y 14% de brewer's caldo de fermentación de levadura e incubado durante 24 h a una temperatura de 28 ℃ y una velocidad de rotación de 160 RPM. La carga óptima se determinó calculando la cantidad total de glutatión, el glutatión intracy la biomasa del brewer's células de levadura, y tres grupos se establecieron para los experimentos paralelos.

2.6.2.2 efecto de la temperatura sobre la síntesis de glutatión

En este experimento, las temperaturas óptimas se determinaron calculando el glutatión total, el glutatión intracy la biomasa celular de brewer's a 24℃, 26℃, 28℃, 30℃ y 32℃, y se determinó el volumen óptimo de carga en el experimento 2.6.2.1, y la incubse llevó a cabo durante 24 horas a una velocidad de rotación de 160 RPM. Se establecieron tres experimentos paralelos.

2.6.2.3 efecto de la concentración de glucosa en el glutatión sintetiz.

En este experimento, cuatro niveles de concentración de glucosa, a saber 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L y 35 g/L, fueron establecidos e incubados durante 24 h a 160 RPM bajo el volumen de carga y temperatura óptisegún lo determinado en los experimentos anteriores 2.6.2.1 y 2.6.2.2. La concentración óptima de glucosa se determinó calculando el glutatión total, contenido de glutatión intracy biomasa celular del brewer's levadura. Se establecieron tres experimentos paralelos.

2.6.2.4 efecto de la concentración de peptona sobre el glutatión sintetiz.

En este experimento se utilizaron cuatro niveles de concentración de peptona, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L y 35 g/L. La incubse llevó a cabo a 160 RPM durante 24 h bajo la óptima carga, temperatura y concentración de glucosa determinada en los experimentos anteriores. La concentración óptima de peptona se determinó calculando el glutatión total, el glutatión intracy la biomasa celular de brewer's levadura. Se crearon tres grupos paralelos.

2.6.2.5 efecto de la concentración de sulfato de magnesio en el glutatión sintetiz.

En este experimento, cuatro niveles de sulfato de magnesio fueron agregados a 1.5 g/L, 2.0 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.5 g/L, respectivamente. Bajo el volumen óptimo de carga, temperatura óptima y concentración óptima de glucosa determinado en los experimentos anteriores, la incubse llevó a cabo a 160 RPM durante 24 horas. La concentración óptima de sulfato de magnesio se determinó calculando la cantidad total de glutatión, el contenido intracde glutatión y la biomasa de brewer's células de levadura. Se establecieron tres experimentos paralelos.

2.6.3 metodología de superficie de respuesta para optimizar las condiciones de cultivo

Con base en los resultados del experimento unidireccional, los tres factores de concentración de glucosa (A), concentración de sulfato de magnesio (B) y temperatura (C) fueron seleccionados, y luego el diseño experimental fue optimipor Box-Behnken, y los factores y niveles del experimento se muestran en la tabla 2.3.

Cuadro 2.3 factores y niveles experimentales

Símbolo de Factor nivel 1 nivel 2 nivel 3

2.6.4 efecto de la concentración del aminoácido Precursor y tiempo de adición

En este experimento se optimizaron las estrategias de adición de aminoácidos precursores en el proceso de biosíntesis de brewer's células de levadura, incluyendo la concentración de glicina (Gly), ácido glutámico (Glu) y cisteína (Cys), y el tiempo de adición de los tres aminoácidos precursores, y por último, se determinó la concentración de adición óptima y el tiempo por la cantidad total de glutatión sintetiz. Las concentraciones de adición inicial de los tres aminoácidos precursores fueron de 10 mmol/L para Gly, 6 mmol/L para Glu, y 4 mmol/L para Cys, y el tiempo de adición inicial fue de 21 h para brewer's células de levadura, y 24 h para brewer's células de levadura.

2.6.4.1 efecto de la concentración de Gly sobre la síntesis de glutatión

Los tres aminoácidos precursores se agregaron juntos, y las concentraciones iniciales de Glu y Cys se mantuvieron sin cambios en 6 mmol/L y 10 mmol/L, respectivamente, mientras que la concentración de Gly se cambió a 3,0 mmol/L, 6,0 mmol/L, 9,0 mmol/L, 12 mmol/L y 15 mmol/L. La concentración óptima de Gly se determinó calculando el glutatión total, contenido de glutatión intrace índices de biomasa celular. El glutatión total, contenido de glutatión intracy biomasa celular de brewer&#Se calcularon las levaduras 39;s para determinar la concentración óptima de Gly e investigar su efecto en la síntesis de glutatión. Se establecieron tres experimentos paralelos.

2.6.4.2 efecto de la concentración de Glu en la síntesis de glutatión

La concentración óptima de Glu se estableció en 3,0 mmol/L, 6,0 mmol/L, 9,0 mmol/L, 12 mmol/L y 15 mmol/L, y la concentración óptima de Glu se determinó calculando la cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy los índices de biomasa de brewer's células de levadura. La cantidad total de glutatión, contenido de glutatión intracy biomasa celular de brewer&#Se calcularon las levaduras 39;s para determinar la concentración óptima de Glu, e investigar el efecto de Glu en la síntesis de glutatión. Se crearon tres grupos de experimentos paralelos.

2.6.4.3 efecto de la concentración de Cys sobre la síntesis de glutatión

Las concentraciones óptimas de Gly y Glu en los experimentos anteriores se mantuvieron sin cambios, y las concentraciones de Cys se cambiaron a 2.0 mmol/L, 4.0 mmol/L, 6.0 mmol/L, y 8.0 mmol/L. La cantidad total de glutatión y el contenido de glutatión intracy los índices de biomasa de brewer&#Se calcularon las células de levadura 39;s para determinar la concentración óptima de Cys para investigar su efecto en la síntesis de glutatión. La concentración óptima de Cys se determinó calculando la cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy los índices de biomasa de brewer's células de levadura para investigar el efecto de Cys en la síntesis de glutatión. Se crearon tres grupos experimentales paralelos.

2.6.5 metodología de superficie de respuesta para optimizar las concentraciones de aminoácidos precursores

Basándose en los resultados de los experimentos de una sola vía, se selecciontres factores, A saber, la concentración de glicina (A), la concentración de ácido glutámico (B) y la concentración de cisteína (C), y luego Box-Behnken optimiel diseño de los experimentos, y los factores y niveles de los experimentos se muestran en la tabla 2.4.

Tabla 2.4 factores y niveles experimentales

Nota: las concentraciones de glicina, ácido glutámico y cisteína se encuentran en MMO /L.

2.6.6 efecto de la sincronización de la adición de aminoácidos precursores en la síntesis de glutatión

Después de determinar las concentraciones óptimas de los tres aminoácidos precursores, los efectos del tiempo de adición de los aminoácidos precursores en la síntesis de glutatión por brewer&#Se investigaron las levaduras 39;s, y los tiempos de adición se determinaron en 13 h, 16 h, 19 h, 21 h y 24 h, respectivamente. El brewer&#Se cultivaron células de levadura 39;s durante 24 h. El tiempo óptimo de adición de aminoácidos precursores se determinó calculando la cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy la biomasa del brewer's células de levadura. Se establecieron tres experimentos paralelos.

2.6.7 determinación de la vida útil del Brewer's levaduras

En este experimento, se midieron los cambios en el crecimiento celular y la cantidad total de glutatión producido por brewer&#Los resultados se obtuvieron a partir del primer día de fresh brewer's colección de levadura para el día 25. La biomasa celular, glutatión total y contenido de glutatión intracdel brewer&#La levadura 39;s se midió diariamente desde el primer día de recolección hasta el 25 día de incubdel brewer& fresco#39;s levadura almacenen en un refrigera 4℃ antes de la incub, y después de la incubde brewer's levadura optimipara 24 h con la adición de aminoácidos precursores, y el aumento incremental en la biomasa celular, glutatión total y contenido de glutatión intracde brewer&#Se calcularon las levaduras 39;s antes y después de la incub. Los cambios incrementales en el glutatión total y el contenido de glutatión intracse calcularon antes y después de la incubde la levadura.

Resultados y análisis

2.7.1 determinación del tiempo de fermentación de células de levadura de cerveza

De acuerdo con los resultados del glutatión total, contenido de glutatión intracy biomasa de células de levadura, los cuales fueron medidos y calculados después de 30 h de brewer's cultivo de células de levadura, los resultados se representan en la figura. 2.1, de la que se puede ver que brewer's las células de levadura estaban sintetizando glutatión intracdurante el período de 0 ha 13 ha medida que las células seguían creciendo, y que el brewer&#El contenido total de glutatión se midió y calculó después de 30 h de cultivo, y el contenido total de glutatión y la biomasa de las células de levadura se trazaron en la Fig. 2.1. A las 13 h a 26 h, el crecimiento de brewer&#Las células de levadura 39;s básicamente se detuvieron mientras el glutatión todavía estaba siendo sintetiz. Estudios han demostrado [62] que la adición de aminoácidos precursores en estas dos etapas puede aumentar la producción de glutatión. La cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy la biomasa de las células de levadura fueron 102,42 mg/L, 4,66 mg/g y 21,46 g/L en las células de levadura frescas de la cervecjusto después de la producción de cerveza. A partir de los datos experimentales, se puede ver que si el glutatión se extrae directamente, el rendimiento de glutatión es bajo y el beneficio económico es bajo, por lo que se considera utilizar la levadura fresca recién salida del tanque para la recultivobjetivo, haciendo pleno uso del sistema enzimde síntesis de glutatión en las células de levadura frescas, proporcionando condiciones adecuadas de nutrición y cultivo para una mayor biosíntesis de glutatión. Como se muestra en la figura 2.1, el glutatión total, el glutatión intracy la biomasa de células de levadura alcanzaron los valores máximos de 26,82 g/L, 7,79 mg/g y 208 mg/L, respectivamente, después de 24 h de incub. Considerando el factor tiempo, se determinó el tiempo óptimo de fermentación de 24 h, lo que ahorrmucho tiempo y recursos en comparación con la fermentación pura.

Figura 2. 1 Brewer's crecimiento de la levadura y curvas de síntesis de glutatión.

2.7.2 efectos de las principales condiciones de cultivo y nutrientes

2.7.2.1 efecto del volumen de carga sobre la síntesis de glutatión

La cantidad de líquido cargado en el experimento se considera principalmente como el nivel de oxígeno disuelto en el brewer's medio de cultivo celular de levadura, que influye en el crecimiento del brewer's, así como la síntesis de glutatión intracelular hasta cierto punto.

Figura 2.2 efecto del volumen de carga sobre la síntesis de glutatión

Fig.2.2 efecto de la carga líquida en la síntesis de glutatión

La figura 2.2 muestra que la cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy la biomasa de las células de levadura aumentó y luego disminuyó con el aumento del volumen de carga. La principal razón de esto puede ser que cuando el volumen de carga era pequeño, el suministro de oxígeno era suficiente y el crecimiento de brewer&#La levadura 39;s fue vigorosa, y el aumento en la biomasa de brewer&#Las células de levadura 39;s llevaron al aumento en la cantidad total de glutatión, y la biomasa de brewer&#Las células de levadura 39;s alcanzaron el valor máximo de 27,12 g/L a un volumen de carga del 8%, y la biomasa del brewer's células de levadura se redujo gradualmente con el aumento del volumen de carga, por lo que el crecimiento de brewer&#Las células de levadura 39;s serían inhibidas a un mayor volumen de carga, y el crecimiento de brewer&#Las células de levadura 39;s serían inhibidas a un mayor volumen de carga. El glutatión total y el glutatión intracalcanzaron el valor máximo de 212.07 mg/L y 7.82 mg/g, respectivamente, al 8%.

2.7.2.2 efecto de la temperatura sobre la síntesis de glutatión

La temperatura es uno de los factores más importantes que afectan al crecimiento de las células de levadura. La temperatura afecta la actividad de la glutatión sintetasa, que a su vez afecta la capacidad de brewer's para sintetizar glutatión, lo que provoca diferencias en la producción de glutatión. El efecto de la temperatura sobre la actividad enzimes que, en general, una temperatura demasiado baja o demasiado alta resultará en una disminución de la actividad enzim, y sólo a la temperatura óptima se maximila actividad enzim.

Como se muestra en la figura 2.3, la biomasa de las células de levadura y la capacidad de sintetizar glutatión aumentaron con el aumento de la temperatura, y los valores máximos de glutatión total, glutatión intracy biomasa de células de levadura se alcanzaron a 28℃, que fueron 216,51 mg/L, 7,85 mg/g y 27,62 g/L, respectivamente.

Figura 2.3 efecto de la temperatura sobre la síntesis de glutatión

2.7.2.3 efecto de la concentración de glucosa en la síntesis de glutatión

La glucosa es esencial para el crecimiento y la reproducción de las células de levadura y la biosíntesis de glutatión. La glucosa puede proporcionar a las células de levadura la energía que necesitan para crecer, y por otro lado, también proporciona ATP para la síntesis de glutatión, que a su vez promueve la síntesis de glutatión. La concentración correcta de glucosa no sólo facilita el crecimiento de brewer's células de levadura, sino también la síntesis de glutatión Por las células de levadura.

Figura 2.4 efecto de la concentración de glucosa en la síntesis de glutatión

Fig.2.4 efecto de la concentración de glucosa en la síntesis de glutatión

Como se muestra en la figura 2.4, la biosíntesis de glutatión aumentó con el aumento de la concentración de glucosa, y la cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy la biomasa de células de levadura alcanzaron los valores máximos a 25 g/L de glucosa, que fueron 211,52 mg/L, 7,82 mg/g y 27,82 g/L, respectivamente. La cantidad total de glutatión, glutatión intracy biomasa de células de levadura alcanzó los valores máximos de 211,52 mg/L, 7,82 mg/g y 27,82 g/L, respectivamente.

2.7.2.4 efecto de la concentración de peptona en la síntesis de glutatión

La fuente de nitrógeno es una de las condiciones importantes para el crecimiento de las células de levadura, y diferentes fuentes orgánicas de nitrógeno tienen un cierto efecto sobre el crecimiento y la síntesis de sustancias intracelulares en la levadura. El experimento investigprincipalmente el efecto de diferentes concentraciones de peptona en la síntesis de glutatión por brewer's levadura. Como puede verse en la Fig. 2.5, el efecto de la concentración de peptona sobre la cantidad total de glutatión no es significativo, y el efecto sobre la biomasa de brewer's las células de levadura tampoco es significativo. En general, el efecto de la concentración de peptona en la producción de glutatión no es evidente, y desde la perspectiva del ahorro de costos, se puede considerar que no se debe añadir peptona en el medio de cultivo en la etapa posterior del estudio.

Fig. 2.5 efecto de la concentración de peptona en la síntesis de glutatión

2.7.2.5 efecto de la concentración de sulfato de magnesio en la síntesis de glutatión

El ion magnesio es esencial para la síntesis de glutatión, que puede aumentar la actividad de la glutatión-cisteína sintetasa (glutatión 1) y la glutatión sintetasa (glutatión 2), reducir la inhibide retroalimentación del glutatión 1, y mejorar la actividad enzim[54]. Por lo tanto, la adición de sulfato de magnesio apropiado durante el proceso de incubes beneficioso para la síntesis de glutatión y mejora la producción total de glutatión.

De la Fig. 2.6, se puede concluir que la concentración de MgSO4 tiene un efecto relativamente grande en la síntesis de glutatión por brewer's, y también tiene un gran efecto en el crecimiento de brewer's células de levadura. Con el aumento de la concentración de MgSO4, la cantidad total de glutatión y la biomasa celular aumentó, y la cantidad total y el contenido intracelular y la biomasa celular de brewer&#Las células de levadura 39;s alcanzaron el máximo cuando la concentración de MgSO4 fue de 2,5 g/L, que fueron 212,88 mg/L, 7,81 mg/g, 27,25 g/L, por lo que la concentración óptima de MgSO4 se puede determinar como 2,5 g/L. 212,88 mg/L, 7,81 mg/g, y 27,25 g/L, por lo que la concentración óptima de MgSO4 se puede determinar como 2,5 g/L. La concentración de MgSO4 fue de 2,5 g/L.

Figura 2.6 efecto de la concentración de MgSO4 en la síntesis de glutatión

2.7.3 experimentos de diseño de superficies de respuesta para optimizar las condiciones de cultivo

Basado en los resultados de los experimentos unidireccionales anteriores sobre la optimización de las condiciones de cultivo para la biosíntesis de glutatión en brewer's levadura, los resultados de la

Un experimento de diseño de superficie de respuesta (RSD) se llevó A cabo utilizando el experto de diseño 10.0 para investigar los efectos de la concentración de glucosa (A), la concentración de sulfato de magnesio (B) Y la temperatura (C) en la cantidad total de glutatión (Y), que fue analizado por análisis de superficie de respuesta (RSA).

2.7.3.1 análisis de regresión de Box-Behnken

Tabla 2.5 Box-Behnken diseño y resultados

Un experimento de diseño de superficie de respuesta de tres factores y tres niveles sobre la síntesis de glutatión en brewer&#La levadura 39;s se llevó a cabo utilizando el software Design Expert 10.0, y los resultados se analizaron mediante análisis de regresión. La ecuación de regresión multinomial cuadrática de los coeficientes de selecdel glutatión total biosintetizpor brewer&#La levadura 39;s con respecto A las concentraciones de glucosa (A), sulfato de magnesio (B) Y temperatura (C) se obtuvo de la siguiente manera: Y= 194.56+ 5.04*A- 5.61*B -7.53*C+ 0.14*AB - 0.20*AC + 5.07*BC + 7.99*A - 2 5.04*A-12.61*B-7.53*C+0. 14*AB-0.20*AC+5.07*BC+7.99*A2-

37. Análisis de varianza (ANOVA)

Tabla 2.6 análisis de varianza para ecuaciones de regresión

Nota: R2=0.9969; R2Adj=0.9930; "*" Denota diferencia significativa (P < 0.05); "**" Denota una diferencia altamente significativa (P < 0.01).

Como se puede observar en la tabla 2.6, el valor F del modelo fue 252.64, y el valor P fue < 0.0001, lo que indicaba que la diferencia del modelo de regresión era altamente significativa, R2=0.9969, lo que indicaba que 99.69% de la variación podía ser explicada por el modelo, R2Adj=0.9930, lo que indicaba que el modelo era significativo, y los valores de R2Y R2Adj eran relativamente cercanos entre sí, lo que indicaba que el modelo de regresión era más razonable, y la ecuación estaba bien ajustada. Los valores de R2 y R2adj están cercanos entre sí, lo que significa que el modelo de regresión es razonable, el ajuste de la ecuación es alto y el error experimental es pequeño, y el modelo puede ser utilizado para analizar y predecir las condiciones de cultivo de la síntesis de glutatión en brewer's levadura. El valor p del término Misfit fue 0,9820 >0.01, lo que indica que la diferencia del término Misfit no fue significativa, es decir, el modelo no tuvo fenómeno Misfit, y el modelo pudo describir bien el experimento, y el modelo se utilizó para analizar los efectos de la glucosa, sulfato de magnesio y la temperatura sobre la producción de glutatión, con el fin de obtener el nivel de molécula de respuesta óptima.

En el modelo, excepto para AB, AC y BC, todos los ítems son significativos, de los cuales A es significativo, B, C, A2, B2 y C2 son altamente significativos, indicando que la glucosa tiene una gran influencia en la producción de glutatión, el sulfato de magnesio y la temperatura tienen una gran influencia en la producción de glutatión, y la relación entre la influencia de los tres factores es B (sulfato de magnesio) > C (temperatura) > A (glucosa).

2.7.3.3 análisis de superficie de respuesta

Combinando los resultados de los términos de primer y segundo orden de la ecuación del modelo, se puede concluir que los efectos de la glucosa (A), sulfato de magnesio (B) y temperatura (C) en la síntesis de glutatión por Brewer&#Las levaduras 39;s son complejas, y no son simples relaciones lineales, y el efecto de la superficie de respuesta es significativo. El diagrama de superficie de respuesta se muestra en la Fig. 2.7.

Figura 2.7 diagrama de superficie de respuesta de la interacción de factores en la síntesis de glutatión por brewer's

(a) sulfato de magnesio - glucosa (b) glucosa - temperatura (C) temperatura - sulfato de magnesio

Fig.2.7 diagrama de la superficie de respuesta de la interacción de varios factores a la síntesis de glutatión por la levadura de cerveza

En la figura 2.7, puede verse que los resultados de los experimentos unidireccionales anteriores son consistentes con los resultados del experimento de diseño de superficie de respuesta (RSD), en el cual la cantidad total de glutatión aumenta y luego disminuye con el aumento en los niveles de los factores que influyen. El experimento de diseño de superficie de respuesta puede reflejar claramente la importante influencia de la interacción de varios factores en los resultados experimentales. La pendiente de la superficie de respuesta representa la fuerza del efecto del factor sobre la cantidad total de glutatión.

Cuanto más cerca están las curvas de nivel a nivel de la superficie de respuesta de una elipse, más significativo es el efecto de la interacción entre los dos factores en los resultados del experimento. Cuando las curvas de nivel de la superficie de respuesta están más cerca de los círculos, la interacción entre los dos factores tiene un efecto menos significativo en los resultados experimentales. De la figura, se puede ver que las interacciones entre los factores fueron significativas a excepción de la interacción entre la temperatura y el sulfato de magnesio, que no fue significativa en la cantidad total de glutatión.

Mediante el análisis del modelo de regresión, las condiciones óptimas para la síntesis de glutatión por brewer' la levadura s tenía una concentración de glucosa de 24.66 g/L, una concentración de sulfato de magnesio de 2.41 g/L, y una temperatura de 28.10 ℃, y la cantidad total de glutatión era de 195.64 mg/L bajo estas condiciones. En el experimento de validación, las condiciones anteriores se repitieron, y la cantidad total real de glutatión fue 198.62 mg/L. La diferencia entre la cantidad total de glutatión obtenida de los experimentos repetidos y el valor predicho no fue grande, lo que indicó que este modelo podría predecir las condiciones de cultivo del brewer's para la síntesis de glutatión mejor, y la cantidad total de glutatión obtenida del análisis de la superficie de respuesta fue un poco menor que la obtenida del experimento de optimización unidireccional, que se debió principalmente al hecho de que el experimento de análisis de la superficie de respuesta y el experimento de optimización unidireccional eran diferentes. La cantidad total de glutatión obtenida después del análisis de la superficie de respuesta fue un poco menor que la de la optimización unidireccional, principalmente porque el experimento de análisis de la superficie de respuesta y el experimento de optimización unidireccional se llevaron a cabo con diferentes lotes de brewer&#Los resultados fueron ligeramente diferentes, como se menciona en los materiales experimentales 2.2.1.

2.7.4 efecto de la concentración de aminoácidos precursores y tiempo de adición

elSíntesis de glutatión en brewer's células de levaduraRequiere una reacción de dos pasos, en la cual los aminoácidos precursores están involucrados en la síntesis de glutatión como sustancias intermedias en la reacción, así que para el sistema de reacción, la concentración de los reactivos tiene una cierta influencia en la síntesis de los productos, y la adición de las sustancias requeridas en el momento adecuado tendrá un cierto efecto en la síntesis de los productos, Así que tenemos que añadir el aminoácido precursor y optimizar la concentración y el tiempo de adición en el momento óptimo de la etapa de biosíntesis de brewer's levadura. Por lo tanto, es necesario añadir los aminoácidos precursores en el momento óptimo durante la etapa de biosíntesis de brewer's, y optimizar la concentración de aminoácidos precursores y el tiempo de adición.

2.7.4.1 efecto de la concentración de Gly sobre el glutatión sintetiz.

Gly, como un reactivo en el segundo paso de la síntesis de glutatión, es Sintetiza partir del intermediario − -glutamcisteína, junto con ATP y Gly, y catalizado por el glutatión 2. Por lo tanto, la concentración de Gly tiene un cierto efecto en la síntesis de glutatión.

Figura 2.8 efecto de la concentración de Gly en el glutatión sintetiz.

La figura 2.8 muestra que el contenido total de glutatión y glutatión intrac, así como la biomasa celular aumentaron con el aumento de la concentración de Gly, lo que indica que el aumento de la concentración de Gly no sólo promueve el crecimiento de brewer's células de levadura, sino que también facilita la síntesis de glutatión por brewer's levadura. Cuando la concentración de Gly fue de 12 mmol/L, el glutatión total y el contenido intracelular alcanzaron el valor máximo, y con el aumento de la concentración, el glutatión total y el contenido intracelular comenzaron a disminuir, y en este momento, el glutatión total fue de 302,54 mg/L, el contenido intracfue de 8,98 mg/g, y la biomasa celular fue de 33,62 g/L. Por lo tanto, la concentración óptima de Gly fue de 12 mmol/L en el momento del valor máximo del glutatión total. Por lo tanto, la concentración óptima de Gly fue de 12 mmol/L en el valor máximo de glutatión total.

2.7.4.2 efecto de la concentración de Glu sobre el glutatión

Glu es el reactante primario para la síntesis de glutatión, y la glutationa-1 cataliza la síntesis de -glutamilcisteína bajo el suministro de energía de ATP, por lo que la concentración de Glu tiene un cierto efecto en la síntesis de glutatión. La figura 2.9 muestra que la cantidad total de glutatión aumentó gradualmente con el aumento de la concentración de Glu, y la cantidad total de glutatión, contenido intracelular y biomasa celular alcanzó el valor máximo cuando la concentración de Glu fue de 6,0 mmol/L, que fueron 309,85 mg/L, 9,12 mg/g y 33,86 g/L, respectivamente, y con el aumento de la concentración de Glu, la cantidad total y contenido intracelular comenzó a disminuir, pero el efecto sobre la biomasa celular comenzó a disminuir. A medida que la concentración de Glu se incrementaún más, la cantidad total de glutatión y el contenido intracelular de glutatión comenzó a disminuir, pero el efecto global sobre la biomasa celular no fue significativo. Por lo tanto, la concentración óptima de Glu para la síntesis de glutatión se determinó en 6.0 mmol/L. La concentración de Glu en la fase de síntesis de glutatión se determinó en 6.0 mmol/L.

Figura 2.9 efecto de la concentración de Glu sobre el glutatión

2.7.4.3 efecto de la concentración de Cys sobre el glutatión

Tanto Cys como Glu son los sustratos iniciales para la síntesis de glutatión, y la síntesis del intermediario glutatión (-glutamilcisteína) es catalizada por ATP y glutatión 1, por lo que la concentración de Cys tiene un efecto sobre la síntesis de glutatión.

Figura 2. 10 efecto de la concentración de Cys sobre el glutatión

Como se muestra en la figura 2.10, con el aumento de la concentración de Cys, la cantidad total de glutatión y biomasa celular primero aumentó y luego disminuyó gradualmente, por lo que se puede observar que el Cys tuvo un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de brewer's, y cuanto mayor era la concentración de Cys, la inhibición más obvia en el crecimiento de brewer's células de levadura. Cuando la concentración de Cys fue 4.0 mmol/L, el glutatión total y el contenido intracalcanzó el valor máximo, y el valor máximo del glutatión total fue 310.42 mg/L, que fue 51.33% mayor que el del grupo control.

2.7.5 metodología de superficie de respuesta para optimizar las concentraciones de aminoácidos precursores

Basado en los resultados de los experimentos anteriores de una sola vía sobre la síntesis de glutatión en brewer's levadura optimide la concentración de aminoácidos precursores.

Los experimentos de superficie de respuesta se llevaron A cabo utilizando el experto en diseño 10.0 para investigar los efectos de la concentración de glicina (A), la concentración de glutamato (B) Y la concentración de cisteína (C) en la cantidad total de glutatión (Y), Y se realizó el análisis de superficie de respuesta, Y los resultados de los experimentos se muestran en la tabla 2.7 Y el análisis de varianza (ANOVA) se muestra en la tabla 2.8.

2.7.5.1 análisis de regresión de Box-Behnken

Tabla 2.7 Box-Behnken diseño y resultados

Usando el software de Design Expert 10.0, un diseño de superficie de respuesta de 3 factores y 3 niveles de experimentos se llevó a cabo en condiciones de síntesis de glutatión en brewer&#Los resultados se analizaron mediante análisis de regresión para obtener la cantidad total de glutatión biosintetizpor brewer's levadura.

Ecuación de regresión multinomial cuadrápara los coeficientes de selecde concentración de glicina (A), concentración de glutam(B) Y cisteína (C): Y=313.77+10.08*A+2.62*B-14.92*C+0. 17*AB+0.018*AC-0. 15*BC- 23.88*A2-13.29*B2-53.22*C2

2.7.5.2 análisis de varianza (ANOVA)

Como se puede observar en la tabla 2.8, el valor F del modelo fue de 275.81, y el valor P fue < 0.0001, lo que indica que la diferencia del modelo de regresión fue altamente significativa. R2= 0,9972 indicó que el 99,72% de la variación podría ser explicada por el modelo, y R2Adj= 0,9960 indicó que la significación del modelo era buena, y los valores de R2 y R2Adj eran relativamente cercanos entre sí, lo que indicó que el modelo de regresión era más razonable, y el ajuste de la ecuación era bueno. Los valores de R2 y R2adj fueron cercanos entre sí, lo que indica que el modelo de regresión fue razonable, el ajuste de la ecuación fue alto, y el error experimental fue pequeño.

Tabla 2.8 análisis de varianza para ecuaciones de regresión

Nota: R2=0.9972; R2Adj=0.9936; "*" Denota diferencia significativa (P < 0.05); "**" Denota una diferencia altamente significativa (P < 0.01).

El valor p del término fuera de ajuste fue 0,1092 > 0,01, lo que indica que la diferencia del término fuera de ajuste no fue significativa, es decir, no hubo fenómeno fuera de ajuste en el modelo, y el modelo fue capaz de describir bien los experimentos. El modelo se utilizó para analizar el efecto del glutamato, glutamato y cisteína en la producción de glutatión y para encontrar el nivel de molécula de respuesta óptima. En el modelo, todos los ítems fueron significativos excepto AB, AC y BC, de los cuales B fue significativo, y A, C, A2, B2 y C2 fueron altamente significativos, indicando que la concentración de glutamato tuvo un fuerte efecto en el rendimiento de glutatión, y las concentraciones de glicina y cisteína tuvieron un fuerte efecto en el rendimiento de glutatión, y la relación entre los tres factores fue C (cisteína) > A (glicina) > B (glutamato). C (cisteína) > A (glicina) > B (ácido glutámico).

2.7.5.3análisis de superficie de respuesta

Combinando los resultados de los términos de primer y segundo orden de las ecuaciones modelo, se puede ver que los efectos de la concentración de glicina (A), la concentración de ácido glutámico (B) y la concentración de cisteína (C) en la síntesis de glutatión por Brewer&#Las levaduras 39;s son complejas, no simples relaciones lineales, y el efecto de la superficie de respuesta es significativo. Los gráficos de respuesta se muestran en la figura 2.11.

Fig. 2. 11 parcelas de superficie de respuesta de 11 aminoácidos precursores a la síntesis de glutatión por brewer's levadura por interacción de factores

(a) glutamatoglicina (b) glicina-cisteína (C) cisteína glutamato

Figura 2. 11 diagrama de superficie de respuesta de la interacción de los aminoácidos precursores con la levadura de cerveza para la síntesis de glutatión

En la figura 2.11, puede verse que los resultados de los experimentos unidireccionales anteriores son consistentes con los resultados del experimento de diseño de superficie de respuesta (RSD), en el cual la cantidad total de glutatión aumenta y luego disminuye con el aumento en los niveles de los factores que influyen. El experimento de diseño de superficie de respuesta puede reflejar claramente la importante influencia de la interacción de varios factores en los resultados experimentales. La pendiente de la superficie de respuesta revela la fuerza del efecto de cada factor sobre la cantidad total de glutatión. Cuanto más cerca está el contorno del plano horizontal de la superficie de respuesta de una elipse, más significativo es el efecto de la interacción entre los dos factores en los resultados experimentales.

Cuanto más cercano está el contorno del plano horizontal de la superficie de respuesta a un círculo, menos significativo es el efecto de la interacción entre los dos factores en los resultados experimentales. Como puede verse en la figura, las interacciones entre los factores fueron significativas, excepto para la interacción entre glicina y cisteína, que no fue significativa para el glutatión total.

Mediante el análisis del modelo de regresión, las condiciones óptimas para la síntesis de glutatión en brewer' la levadura s fue de 12,64 mmol/L para la glicina, 6,30 mmol/L para el glutamato, y 3,72 mmol/L para la cisteína, y la cantidad total de glutatión fue de 316,01 mg/L bajo estas condiciones. En el experimento de validación, las condiciones anteriores se repitieron, y la cantidad real de glutatión fue de 315.65 mg/L. La cantidad total de glutatión obtenida de los repetidos experimentos no fue muy diferente del valor predicho, lo que indicó que este modelo bien podría predecir las condiciones de cultivo para la síntesis de glutatión en brewer's levadura.

2.7.6 efecto del tiempo de adición del aminoácido Precursor sobre el glutatión

Brewer's el crecimiento de células de levadura se divide en dos fases: la primera fase es el crecimiento de la propia célula de levadura, en la que la propia célula de levadura crece y aumenta en número, con una pequeña cantidad de síntesis del glutatión de levadura; La segunda fase es la síntesis de glutatión intrac, debido al agotamiento de la glucosa y otros nutrientes en el cultivo, la propia célula alcanza un pico en número, y luego la síntesis de contenidos celulares, incluyendo una gran cantidad de síntesis de glutatión, Liang Bin et al. La segunda etapa es la etapa de síntesis de glutatión intrac, en la cual el número de células alcanza su punto máximo debido al agotamiento de glucosa y otros nutrientes en los componentes de cultivo, seguido por la síntesis de contenido celular, incluyendo la gran cantidad de síntesis de glutatión. Después de 30 h de incub, el contenido intracelular fue de 10,41 g/L, que fue 10,5% mayor que el control, y la producción de glutatión fue de 278 mg/L, que fue 116% mayor que el control.

Estudios relevantes han demostrado que la adición de aminoácidos precursores en la etapa de la síntesis de glutatión aumentará aún más la cantidad total de glutatión, por lo tanto, de acuerdo con la síntesis de glutatión en el brewer&#Células de levadura 39;s en este experimento, fijamos el tiempo de adición de aminoácidos precursores a la brewer&#Células de levadura 39;s en las 13, 16, 19 y 24 h de cultivo celular.

Fig. 2. 12 efecto del tiempo de adición de aminoácidos precursores mixtos sobre el glutatión

Fig.2. 12 efecto del tiempo de adición del aminoácido precursor sobre el glutatión

Como se muestra en la figura 2.12, con el aumento del tiempo de adición, el contenido de glutatión y el contenido intracelular alcanzaron el valor máximo a las 21 h, y la biomasa celular también alcanzó el valor máximo, pero no hubo mucha diferencia en el nivel general, y la cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intrac, y la biomasa de las células de levadura disminuyeron significativamente a las 24 h, Que estaba cerca de la máxima producción de glutatión en células de levadura bajo condiciones de cultivo optimi, pero sin la adición de aminoácidos precursores. La cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy la biomasa de células de levadura disminuyeron significativamente a las 24 h, lo que fue cercano a la producción máxima de glutatión en células de levadura bajo condiciones de cultivo optimisin la adición de aminoácidos precursores. La razón de esto puede ser que la adición de aminoácidos precursores a las 24 h fue el final de la fermentación de brewer's células de levadura y la levadura Las células eran incapaces de sintetizar su propio glutatión a partir de los aminoácidos precursores en un corto período de tiempo. Cuando el tiempo de adición fue de 21 h, el contenido máximo de glutatión fue de 315,87 mg/L, un 52,51% superior al del grupo control, por lo que se determinó que el tiempo de adición óptimo fue de 21 h. Los resultados mostraron que la producción de glutatión de la levadura fue superior a la del grupo control.

2.7.7 determinación del tiempo de retención celular de Brewer's levaduras

Durante la investigación experimental de brewer's, se encontró que la capacidad de las células de levadura para sintetizar glutatión bajo las mismas condiciones disminuyó con la extensión del tiempo de almacenamiento después del brewer& fresco#Se recuperó la levadura 39;s, y la capacidad de la levadura para sintetizar glutatión se debilicon la extensión del tiempo de almacenamiento. Por lo tanto, con el fin de garantizar la estabilidad de los datos experimentales, el tiempo de almacenamiento de brewer&#Las células de levadura 39;s se midió para asegurar que los experimentos se llevaron a cabo tan pronto como sea posible antes de la disminución en la capacidad de brewer's células de levadura para sintetizar glutatión, a fin de captar con precisión la exactitud de los resultados de los experimentos.

Fig. 2. 13 cambios en la biomasa celular e incremento en la producción de glutatión en brewer's levadura antes y después de la optimización de más de 25 d.

De la Fig. 2.13, se puede ver que con el aumento del tiempo de almacenamiento, la tasa de aumento de biomasa del cultivo optimide brewer's las células de levadura disminuyeron gradualmente, lo que indica que el crecimiento de brewer&#Las células de levadura 39;s con mayor tiempo de almacenamiento no aumentaron significativamente después de la optimización, y esto puede ser debido principalmente al hecho de que la actividad de brewer's células de levadura se perdió mucho, y el aumento de la cantidad total de glutatión fue pequeño, lo que no fue propicio para la posterior operación experimental de aislamiento.

The physiological activity of brewer& (en inglés)#La levadura 39;s disminuyó con el aumento del tiempo de almacenamiento, y su crecimiento y capacidad de producción de glutatión disminuyó con el aumento del tiempo de almacenamiento a baja temperatura. La cantidad total de glutatión, el contenido de glutatión intracy la tasa de aumento de la biomasa de células de levadura disminuyeron en un 5%, 7% y 9%, respectivamente, cuando el tiempo de almacenamiento fue superior a 5 d. Por lo tanto, es mejor cultivar la levadura dentro de los primeros 5 d después de que la levadura fresca se dejó de los tanques con el fin de aumentar el rendimiento del glutatión biológicamente sintetizen brewer's levadura. Por lo tanto, es mejor incubar la levadura para la producción de glutatión dentro de los primeros 5 d después de tomar brewer& fresco#39;s levadura fuera del tanque con el fin de aumentar el rendimiento de la biosíntesis de glutatión por brewer's levadura.

3. Resumen resumen

En este experimento, utilizamos brewer's como cepas, e investigó las condiciones de cultivo y la estrategia de adición de aminoácidos precursores para mejorar la capacidad de brewer's para sintetizar el glutatión por sí solo. Se obtuvieron las siguientes conclusiones:

(1) a través de la optimización unidireccional de las condiciones de cultivo, finalmente se determinó que los componentes principales del medio de cultivo fueron glucosa y MgSO4, con las concentraciones de 22 g/L~28 g/L y 2.0 g/L~3.0 g/L, respectivamente, y las condiciones externas de 26℃~28℃, con un volumen líquido de 8%. Sobre la base del método de diseño de superficie de respuesta, los tres factores principales de la concentración de glucosa, la concentración de sulfato de magnesio y la temperatura fueron optimipara obtener las condiciones óptimas del proceso: la concentración de glucosa de 24,66 g/L, la concentración de sulfato de magnesio de 2,41 g/L, y la temperatura de 28,10 ℃. Bajo estas condiciones, la cantidad total de glutatión fue 198,62 mg/L, que fue 93.93% más alta que la cantidad inicial de glutatión. El tiempo óptimo de incubde la brewer's fue de 24 h, que se determinó midiendo los cambios de crecimiento del brewer's levadura.

(2) a través de la optimización de una vía de glicina, ácido glugámico y cisteína, los tres aminoácidos precursores fueron finalmente determinados para ser añadia una concentración de 9,0 mmol/L a 15 mmol/L para Gly, 3,0 mmol/L a 9,0 mmol/L para Glu y 2,0 mmol/L a 6,0 mmol/L para Cys, y sobre la base de esto, las condiciones óptimas del proceso se obtuvieron mediante el uso del método de diseño de superficie de respuesta para optimizar aún más los tres factores principales Gly concentración, concentración de Glu y concentración de Cys. Sobre esta base, los tres factores principales de concentración Gly, concentración de Glu y concentración de Cys fueron optimiutilizando el diseño de la superficie de respuesta para obtener las condiciones óptimas del proceso: concentración de glicina de 12,64 mmol/L, concentración de ácido glutámico de 6,30 mmol/L, concentración de cisteína de 3,72 mmol/L, y la cantidad total de glutatión obtenido bajo estas condiciones fue de 315,65 mg/L. En comparación con las condiciones óptimas del proceso, la cantidad total de glutatión obtenida bajo las condiciones óptimas del proceso fue de 315.65 mg/L. La cantidad total de glutatión se incrementó en un 58.92% en comparación con las condiciones óptimas y 208.19% en comparación con la cantidad inicial de glutatión. Al optimizar el tiempo de adición de los aminoácidos precursores, se determinó que el tiempo de adición era de la 21 hora después de la incubde brewer's levadura.

(3) por último, el tiempo de conservación de brewer&#Se investigaron células de levadura 39;s. Después de 25 días, el estudio mostró que la producción de glutatión, contenido intracelular y biomasa celular de brewer&#La levadura 39;s disminuyó con la prolongación del tiempo de conservación, y el porcentaje del aumento en la producción de glutatión, contenido intracelular y biomasa celular de brewer&#La levadura 39;s disminuyó con la adición de aminoácidos precursores, por lo que el experimento debe llevarse a cabo dentro de los 5 días después del brewer& fresco#La levadura 39;s fue sacada del tanque para aumentar su producción. Por lo tanto, el experimento debe llevarse a cabo dentro de 5 d después de la cerveza fresca#La levadura 39;s fue extradel tanque para aumentar el rendimiento y asegurar la estabilidad de los datos experimentales.