Cómo sintetizar el extracto de Ginkgo ácido ginkgólico?

Ginkgo bilobunL. es la especie de árbol viviente más antigua del planeta y es conocido como el "Golden living fossil". Como gimnosperma económico único en China, tiene múltiples valores como alimena(fruta blanca), medicina (hojas y fruta blanca) y plantas ornamentales. Las nueces de Ginkgo (semillas) son una famosa fruta seca que promueve la salud en China. Como alimenacon propiedades medicinales de alavalor nutricional, los ginkgolidos que contiene son potenciales ingredientes activos contra el virus 2019-nCoV [1]. Las hojas de Ginkgo biloba son ricas en flavonoides y lactonas. La extracción de Ginkgo biloba (EGB) con acetona-agua como agente de extracción puede enriquecer aún más las dos sustancias activas para tratar eficazmente las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares [2]. El Ginkgo biloba es un árbol ornamental de fama mundial para el paisajcon su forma de hoja única, color de hoja dorado y forma de árbol vertical. En la actualidad, el ginkgo ha sido ampliamente desarrollado en las industrias farmacéutica, alimenticia, cosmética, bonsái y maderera, y es una de las especies arbóreas económicas clave para la actual y futura revitalización de la economía rural y la construcción de una hermosa China.

Desde la década de 1970, China's ginkgo recursos han crecido rápidamente, y los recursos existentes representan más del 80% del mundo#39;s total. Los árboles de Ginkgo se distribuyen en todas las provincias (incluyendo las introducidas desde otros lugares), a excepción de Hainan, Heilongjiang y Mongolia interior. En la actualidad, el área cultivada de ginkgo en China es de más de 333.300 HM2, con una producción anual de cerca de 11.000 toneladas de nueces de ginkgo y 10.000 toneladas de hojas verdes secas. El valor de la producción anual de la industria primaria del cultivo del ginkgo es de unos 2 mil millones de yuanes, y la industria secundaria del procesamiento del ginkgo y la producción farmacéutica (medicina de la hoja de ginkgo) vale más de 10 mil millones de yuanes.

Senembargo, alrededor de 30.000 toneladas de capas de semillas exteriores se desechan cada año debido a la producción. Zhang Xinhui etal. [3] mostraron que la capa exterior de la semilla contiene sustancias activas como ácido ginkgolic, flavonoides, lactonas terpénicas y polisacáridos. Itokawa et al. [4] mostraron que el ácido ginkgólico es otra sustancia activa importante en el ginkgo biloba, además de la ginkgolida y la ginkgoflavona. Tiene efectos bactericidas, bacteriostáticos, antiinflamatorios, antivirales, repelde insectos e insectici, y es de gran valor para el desarrollo. Por lo tanto, la gran cantidad de capas de semillas desechno sólo contamina el medio ambiente, sino que también causa un desperdide recursos.

En la década de 1970, Gellerman et al. [5-7] detectaron el ácido fenóginkgolide de las hojas de ginkgo, las semillas inmaduras y las capas externas maduras de las semillas. Las mediciones cuantitativas posteriores mostraron que el ginkgolide se concentra en las capas de semillas externas maduras. Wang Jie et al. [8] y Li Hongqing et al. [9] usaron espectrode masas para identificar cuatro ácidos ginkgolicos y dos ginkgolidos de extractos ácidos de ginkgo. La investigación médica moderna ha demostrado que los ginkgolides tienen cierta toxicidad alergénica y citotoxicidad, pueden resistir el crecimiento de bacterias y hongos, y tienen el efecto de matar plagas.

Los experimentos de cultivo de campo han demostrado que los ginkgolidos pueden ser desarrollados como biopesticidas, y pueden ser utilizados en una amplia gama de campos como la medicina y la cosmética en el futuro. Senembargo, en comparación con sustancias con claras actividades farmacológicas como los flavonoides ginkgo y las lactonas terpen, la vía de biosíntesis, el mecanismo regulador y la eficacia derivada del ácido ginkgólico no han sido estudiados en profundidad, lo que ha retrasla investigación y el desarrollo de técnicas de biología molecular para inhibir la síntesis del ácido ginkgólico y la aplicación de ingeniería de la fermentación para producir altos rendimientos de ácido ginkgólico, Así obstaculizel desarrollo posterior de la industria del ginkgo.

En vista de ello, el autor resume la investigación básica sobre la actividad biológica de ginkgolides en los últimos años, detalla la vía de síntesis de ginkgolides, que se compone de la síntesis de ácidos grasos y la síntesis de poliquetida, resume el mecanismo catalítico de las enzimas clave involucradas en la síntesis, y mira hacia el futuro de la investigación en la dirección, con el objetivo de proporcionar referencia y apoyo teórico para la investigación posterior sobre ginkgolides.

1 actividad biológica de ginkgolides

El ácido ginkgolida pertenece a la familia de los lípidos fenó, que tiene cuatro categorías principales: alquilfenoles, alquilresorcinoles, ácidos anacárdicos y alquilcatecolos [10]. Son una clase de metabolitos secundarios en plantas. Diferentes especies de plantas pueden contener sustancias fenóúnicas. Su principal función fisiológica es resistir los estresbióticos y abióticos.

1.1 composición del Ginkgolide y propiedades físicas y químicas

Los ginkgolida son importantes metabolisecundarios del ginkgo biloba, y pertenecen a la clase de lacas. Incluyen tres componentes: ácido ginkgólico, ginkgol y bilobol [11]. El ácido ginkgólico es un ácido 2-hidroxi6-alquenilo (alquinil) benzoico (Fig. 1a) con una longitud de cadena lateral de 13, 15, o 17 y un doble número de enlace de cadena lateral de 0 a 2. Un total de cinco tipos han sido aislados e identificados, A saber, ácido ginkgolic B, ácido ginkgolic A, ácido ginkgolic, heptadec-1-enylginkgolic ácido y heptadec-1-dienylginkgolic ácido. Los ginkgolidos son 3-alkenilfenoles con una longitud de cadena lateral de 15 o 17 y una cadena lateral doble cuenta de enlace de 1, y hay dos tipos en total; Los ácidos ginkgólicos son 5-alquilresorcinoles con una longitud de cadena lateral de 15 o 17 y un doble enlace de cadena lateral de 2 (Fig. 1b), y hay dos tipos en total.

Plantas como el geranio (Pelargonium hortorum) en la familia de las Geraniaceae [12] y el sumac (Anacardium occidentale) en la familia de las Anacardiaceae [13] también contienen ácidos urushiólicos. Las longitudes de las cadenas laterales alkyl/alkenyl y el número de enlaces insaturados, y así sucesivamente, pero la estructura química es similar a la de ginkgolides. Los ácidos ginkgolicos son las sustancias principales en los ginkgolida, representando el 90% de todo el extracto ácido. Las proporciones de los cinco ácidos ginkgolic son diferentes, incluyendo principalmente el ácido ginkgolic (50% contenido), seguido por el ácido ginkgolic heptadec-1-enil (22%) y el ácido ginkgolic (20%) [14] (figura 2). El contenido total de ácido ginkgo de las hojas de ginkgo de diferentes variedades (cepas) es de aproximadamente 14.5765-23.6813 mg/g [15], y el contenido total de ácido ginkgo de los granos maduros es de aproximadamente 0.11 mg/g [14]. Y el contenido total de ácido ginkgólico en la capa externa de la semilla puede alcanzar 28,78 mg/g [16].

El punto de fusión del ácido ginkgólico es 41-42°C. A temperatura ambiente, el ácido ginkgólico puro es oleoso o en polvo en apariencia, y es poco soluble en disolventes polares como agua o etanol, pero fácilmente soluble en disolventes no polares como éter de petróleo ligero. Se precipcomo cristales en el solvente éter de petróleo satur[17]. En solución, los grupos hidroxilo y carboxilo en el anillo de bencende de ácido fenóse ionipara producir un ácido débil, que puede sufrir reacciones de esterificación y saponificación. El ácido ginkgólico que ha sufrido esterificación o saponificación es más fácil de extraer y separar, logrando el efecto de purificación. El punto de fusión del ácido ginkgólico es de unos 136 °C y el punto de ebullies de unos 500 °C. A 200 °C, el grupo carboxilo en el anillo de bencenácido fenóexperimentará una reacción de descarboxilación para liberar CO2, que puede ser separado usando el método del gradiente de temperatura. Por lo tanto, de acuerdo con la investigación de la propiedad física y química, en el procesamiento de productos de ginkgo, métodos como "cocción al aire caliente", "extracción asistida por ultrasonido del ácido fenóde ginkgo con adsorde resina" y "compatibilidad de hierbas medicinales chinas" se utilizan a menudo para eliminar los ácidos fenópara lograr el propósito de desintoxicación. Chen et al. [18] los últimos resultados de la investigación muestran que la laccase inmovilizen en un nuevo tipo de fielde de nanofibra electrohilpuede catalizar la degradación del ácido fenóginkgo. Senembargo, los métodos mencionados anteriormente para el tratamiento con ácido defenótienen desventajas como un alto costo y dificultad de operación, y no son adecuados para la desintoxicación a gran escala.

1.2 actividad biológica de ginkgolides

Los ginkgolidas tienen efectos antibacterianos, insectici, alergénicos, citotóxicos y anticancerosos. Sus diversas actividades biológicas pueden ser explotadas en la producción agrícola, la salud y otros campos.

1.2.1 efecto antibacteriano

El ácido Ginkgo es un ácido 6-alquilsalicílico, que tiene una amplia gama de propiedades antibacterianas. Tiene un efecto inhibitorio sobre Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, y una variedad de bacterias gramnegativas y grampositivas [19-20]. Su ácido extractante tiene un efecto inhibitsobre el hongo de la vaina del arroz, el hongo de la marchitadura del tomate, el hongo antracnode de manzana, el hongo de la mancha de la hoja de maíz y el hongo del moho rojo, y su efecto antibacteriano es comparable al de algunos medicamentos antifún[21]. Xu Lichun et al. [22] mostraron que el ácido ginkgoico 0,1% (15:1) tuvo una tasa efectiva de 92% en la inhibición de hongos, mientras que el clotrimazol 0,5% tuvo solo 68% de eficacia. Muroi et al. [23] mostraron que el ácido ginkgoico tuvo un efecto sinérgico con los medicamentos antibacterianos estándar para matar al Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, y la actividad bactericida de la combinación fue por lo menos 100 veces más alta que la del medicamento único en 48 horas.

1.2.2 efecto insectici.

El ácido Ginkgolide se ha demostrado que tiene un efecto significativo de matar a los pulgones, larvas, polillas de la col, ácaros de la araña, garrapatas de la morera, broca del arroz y otros insectos de las partes bucde mastic[20]. En una prueba para controlar los áfidos, Shi Qitian [24] encontró que el efecto asesino del extracto ácido de ginkgolide era comparable al del pestiimidacloprid. Deng Yecheng et al. [25] usaron diferentes polaridades de los extractos de exocarpo en pruebas de toxicidad por contacto y encontraron que tenían un fuerte efecto devastador sobre el planplanmarrón, el pulgón del melocotón, la araña roja y las larvas de la mariposa de la col.

1.2.3 efectos alérgicos

En 1934, Hill et al. [26] informaron que una sustancia activa en el ginkgo tiene un fuerte efecto erosivo sobre la piel. En 1969, Gellermen aisllos ácidos fenóde laca de las nueces de anacú y las semillas de ginkgo, respectivamente, y señaló que tienen un fuerte efecto sensibilizante sobre la piel [5]. Cheng Liang et al. [27] informaron que el ácido ginkgolico (C15:1) se metaboliza a ginkgolida, que se oxida aún más para formar catecol, causando una reacción alérgica. Vincieri et al. [28] mostraron que el ácido ginkgólico puede inhibir la actividad de varias deshidrogenasas en el metabolismo de la glucosa. Ahlemeyer et al. [29] encontraron que el ácido ginkgo tiene un efecto inhibitcompetitivo sobre la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa. Algunos estudiosos especulque el ácido ginkgólico tiene una naturaleza bipolar (hidrofílico y lipofílico) y puede inhibir la actividad de las enzimas relacionadas con el cuerpo u órganos, afectando así el metabolismo y causando alergias [30].

1.2.4 citotoxicidad

El Ginkgolide tiene dos grupos hidrófilo y lipofílico, que pueden unirse a la membrana celular a través de la membrana y causar la muerte celular. Al-Yahya et al. [31] usaron extracto de ginkgo que contenía ácido de ginkgo para realizar una prueba de toxicidad en ratas macho y los resultados mostraron que el extracto puede causar la pérdida de cromosomas como las células germinativas, afectando la función reproductiva normal de las ratas. Ahlemeyer et al. [29] encontraron que el ácido ginkgolide tiene neurotoxicidad y puede llevar a la muerte de las células del neuroblastoma de pollo. En los últimos años, los investigadores han realizado estudios separados sobre la toxicidad de varios ácidos ginkgo. Jiang et al. [32] encontraron que el ácido ginkgo (C15:1) puede causar estrés oxidativo y daño a las células del hígado de rata al inducir trastornos metabólicos de purina. Yao et al. [33] encontraron que la toxicidad del ácido ginkgo heptadecilideno (C17:1) para las células HepG2 es directamente proporcional al tiempo y la dosis, y aumenta la citotoxicidad mediando el metabolismo de CYP1A y CYP3A. Los estudios han demostrado que entre los ginkgolidos, el ácido ginkgolic (C13:0), el ácido ginkgolic (C15:1) y el ácido heptadecilideno ginkgo (C17:1) son más tóxicos, y otros ácidos fenópueden actuar en combinación con los tres ácidos ginkgo para aumentar la citotoxicidad.

1.2.5 efecto contra el cáncer

Los ginkgolidos tienen citotoxicidad y pueden desempeñar una función contra el cáncer. Qiao et al. [34] encontraron que el ácido ginkgo puede inducir la activación de la proteína quinasa activpor monofosfato de adenosina (AMPK) para inhibir la proliferación y la migración. Liang et al. [35] encontraron que el ácido ginkgo puede inhibir el crecimiento de células de cáncer gástrico al inhibir la vía de señalización de STAT3/JAK2 regulada por ros. Liu et al. [36] mostraron que el ácido ginkgo puede bloquear la transición de las células de cáncer de El colondesde la fase G0/G1 de la división celular, lo que lleva a la muerte de las células cancerosas. Experimentos celulares In vitro han demostrado que el ácido ginkgo puede inhibir la proliferación y migración de células cancerosas y activar enzimas relacionadas para promover la apoptosis. Y puede convertirse en un medicamento adyuvcontra el cáncer para el tratamiento de tumores en el futuro.

2 Ginkgolide biosíntesis

En la década de 1970, Gellerman de la universidad de Minnesota en los Estados Unidos utilizó el método de etiquetado 14C para llevar a cabo una exploración preliminar de la vía de síntesis de ácido de ginkgolide. En la década de 1990, Walters et al. [37] usaron la cromatogaslíquida (atrapglc) para analizar ésteres monometílicos etiquetados extraídos de la cromatolíquida (HPLC), y determinaron los pasos sintéticos específicos de Urushiol (2-hidroxi6-alk (en) ácido il-benzoico) en geranio. Singhal [38] y Narnoliya et al. [39] investigaron además los tipos y funciones de las enzimas clave en la síntesis de Urushiol.

2.1 Ginkgolide biosynthetic pathway

Gellerman et al. [6-7] creen que el anillo aromático y el grupo alquilo/alkenilo de cadena larga del ginkgolide se sintetizpaso a paso, de acuerdo con la inferexperimental, se divide en tres partes: − malonil-coa y acetil-CoA forman palmitoil-coa y oleoil-coa libres a través de la síntesis de ácidos grasos; − acil-coa de cadena larga es sintetizpara formar ácido ginkgólico a través de la síntesis de poliquetida; − el ácido ginkgólico pierde el grupo carboxilo del anillo de benceny se oxiy reduce a sustancias como el ginkgol.

Pelargonium hortorum es una planta perteneciente a la familia Geraniaceae. Sus tricomas sólo secretan ácido siquímico (un homódel ácido ginkgoico), por lo que es la mejor especie para estudiar la vía de síntesis de ácido siquímico. El geranisilvestre segregácido shikimic con una cadena lateral satur, mientras que los tipos resistentes a los insectos secretan ácido shikimic con una cadena lateral monoinsatur(C15:1 y C17:1). Estudios han encontrado que el ácido urushiol insaturen los geranios es idéntico en estructura molecular a los dos ácidos ginkgolic (ácido ginkgolic (C15:1) y ácido ginkgolic (C17:1)) excepto por la diferencia en la posición del doble enlace. Hesk et al. [12] compararon los genes diferenciales y metabolide geranios de tipo silvestre y resistentes a insectos, y revelaron el mecanismo molecular de la síntesis de urushiol. Los investigadores utilizaron la tecnología RNA-seq para construir una base de datos de transcriptode cDNA de gerani, e identificaron los genes clave para la síntesis de ser el gen Polyketide Synthases Ⅲ (PKS Ⅲ) y el gen Stearyl-ACP desaturasa (SAD) a través de la comparación de anotación génica y el análisis de expresión diferencial. La vía reguladora de la síntesis de ginkgoda se explica usando el ácido ginkgolic (15:1) y el ácido inkgolic heptadecylideneg(17:1) como ejemplos.

2.1.1 síntesis de la cadena lateral de alquilo

La síntesis de ginkgolides se basa primero en la síntesis de ácido palmitoleico y ácido oleico, es decir, la síntesis de la cadena lateral de alquil. la fermentación de la sacarosa almacenen fosfoenolpiruvato, el cambio alostérico de piruvato quinasa (piruvato quinasa) para formar piruvato del citoplasma en el plastid, y la catálisis de piruvato deshidrogenasa (piruvato deshidrogenasa, PDH) para formar acetil-CoA proporciona la molécula 2C inicial para los ácidos grasos. La acetil-CoA es catalizada por acetil-CoA carboxilasa (Ace- til-coa carboxilasa, ACC) para formar malonil-coa. La transacilasa (TA) reempla la molécula CoA con una proteína transportacilo (ACP) para formar malonil-acp. Malonil-acp pierde su grupo carboxilo para convertirse en acetil-acp, y se condensa en un ciclo por la -cetoacil-acp sintasa III(KAS III) para formar el material de partida 4C acil-acp.

El acil-acp 4C es repetidamente condensado por la -cetoacil-acp sintasa I (KAS I) para formar palmitoil-acp (C16:0 ACP), que luego es deshidrogenado por la -9-estestaroil-acp desaturasa (SAD) para formar palmitoléico-acp (− 9 C16:1 ACP). SAD) es deshidrogenado a ácido palmitoleico -ACP (− 9 C16:1 ACP), y luego catalizado por la cetoacil-sintasa II (− -cetoacil-acp sintasa -, KAS -) para formar ácido oleico -ACP (− 11 C18:1 ACP). Palmitoil-acp y oleooacp en los plastidos son respectivamente desacetilpor tioesterasa A (TE/FatA) y tioesterasa B (TE/FatB) para formar ácidos grasos insaturados libres [40]. Finalmente, los ácidos grasos libres se convierten en palmitoleil-coa (− 9 C16:1CoA) y oleoil-coa (− 11 C18:1CoA) por la acil-coa sintasa (ACS) en la membrana externa del plastid, y se transfial citoplasma para convertirse en los dos precursores importantes de los ácidos ginkgolic.

Senembargo, las vías de síntesis de ácidos grasos del ácido ginkgólico y geranilgeranilo son diferentes. Los precursores para la síntesis de ácido ginkgolic (C15:1) y ácido inkolic heptadecylideneg(C17:1) son ácido palmitoleico (− 9 C16:1) y ácido oleico (− 11 C18:1), mientras que los precursores para la síntesis de las 2 cadenas laterales monoenilo de ácido oleico son ácido palmitoleico (− 11 C16 − 1) y ácido oleico (− 13 C18 − 1). Los ácidos grasos comunes − -7 (ácido palmitoleico (− 9 C16 − 1) y ácido oleico (− 11 C18 − 1)) pueden formarse en muchas plantas silvestres y algas a partir de palmitoil-acp (C16 − 0 ACP) por desatur, policetona y otras reacciones. Schultz et al. [41] encontraron que un nuevo tipo de geranilo ACP desaturasa en geranideshidrogeniza ácido mirístico -ACP (C14:0 ACP) para formar ácido mirístico -ACP (− 9 C14:1), y luego se someten a policetida y otras reacciones para formar dos ácidos grasos monoinsaturados (ácido palmitoleico (− 11 C16:1) y ácido oleico (− 13 C18:1)). Por lo tanto, la vía sintética de los ácidos grasos precursores del ácido ginkgólico es más fácil de explorar que la del ácido pelargonólico en los geranios.

Singhal [38] identificó y verificla expresión de genes relacionados con la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados (ácido palmitoleico y ácido oleico) en geranio. Los resultados mostraron que cuando la expresión génica de las proteínas portadoras de acilo (ACPs), ketoacil sintasa (KASs) y tioesterasas (TEs) en el tejido era alta, el contenido de ácidos grasos y ácido ursólico también era alto. La proteína transportacil (ACP) es un transportador intermedio conservado que es central para el proceso de síntesis de ácidos grasos. Trabaja con la acil-acp desaturasa (AAD) para desaturla la cadena acilo, cambiando la relación de ácidos grasos saturados e insaturados. También puede actuar como una enzima limitante de la velocidad junto con la cetoacil-acp sintasa (KAS) para regular la tasa de síntesis de ácidos fenó.

2.1.2 síntesis del anillo de fitilbenceno

La síntesis del anillo de fitilbenceno es un paso clave en la formación de ácidos fenóa partir de ácidos grasos superiores. La vía de síntesis se muestra en la figura 4. Tomando ácido gammacerolico (C15:1) como ejemplo, en primer lugar, palmitoilo (− 9 C16:1) de la vía de los ácidos grasos utiliza malonil-coa como sustry bajo la acción de la policetida Syn- tasa - (PKS -), cuatro átomos de carbono se añaden al extremo acilo a través de una reacción de condensde dos pasos; En segundo lugar, el grupo cetona en la posición C3 se reduce por la cetona reductasa (PKS- cetoacil-coa reductasa, KR) para formar un grupo hidroxilo, y un doble enlace se forma por la deshidratasa (PKS-dehydratase, DH) elimina una molécula de agua para formar un doble enlace; En tercer lugar, después de la condensación y la polimerización, se añaden dos átomos de carbono más al extremo acilo. En este momento, el ion hidrógeno en la posición C2 se acerca más al grupo cetona en la posición C7 para mantener la estabilidad de la estructura intermedia del 4,15-dieno tripéptido; Cuarto, asegurando que el grupo cetona en C1 no descarboxilato, la ciclas(pks-ciclas) cataliza la ciclización del ion hidrógeno en C2 con el grupo cetona en C7, similar a una condensaldólica, y un doble enlace se forma bajo la acción de la deshidratasa (pks-dehidratasa); Quinto, la enoil-reductasa (PKS-enoyl reductasa, ER) cataliza la formación de un doble enlace y la aromatización del grupo cetona en el anillo de carbono hexagonal. Junto con el grupo carboxilo C1 forman la estructura del ácido benzoico; Finalmente, la cadena lateral monoinsaturse forma para producir ácido ursólico (C15:1) [37,39].

Planta tipo IIIpoliketide sintasa (PKS III) es la enzima limitante para la síntesis de lípidos fenó(alquilfenoles, alquilres- cyls, urushiols, alquilcatechols, etc.) [42]. La sintasa de Chalcone (CHS) y la sintasa de (en millones de ecus)(STS) son dos de las superfamilias más representativas. STS) son dos de las superfamilias más representativas. Pueden catalizar la condensación y ciclación de las cadenas acilo en las posiciones C1 y C6 (condensde Claisen) y en las posiciones C2 y C7 (condensaldol), respectivamente, para formar sustancias fenólicas. Senembargo, los ácidos urónicos pueden catalizar la condensdel ion hidrógeno en la posición C2 con el grupo cetona en la posición C7 mientras retienen el grupo carboxilo en la posición C1 para formar ácido benzoico. Esta reacción de cicde policetida que retiene el grupo carboxilo del anillo de bencenes es relativamente rara en las plantas. Por lo tanto, la investigación adicional sobre policetida sintasa tipo III (PKS III), ciclas(pks-ciclas) y cetoacil-coa reductasa (pks-cetoacil-coa reductasa, KR) puede revelar aún más el mecanismo de la síntesis del ácido ginkgolic, y el contenido de ácidos fenóen los tejidos de ginkgo puede ser controlado mediante la combinación de métodos físicos y químicos o biotecnológicos.

2.2 genes clave de enzimas para la síntesis de ácidos fenó.

En la actualidad, los principales informes sobre la investigación de genes de enzimas clave para la síntesis de ácidos fenóprovienen de urushiol, mientras que hay pocos informes sobre ginkgolides. La vía de síntesis de ácidos fenóse divide en 2 partes: síntesis de ácidos grasos y síntesis de anillos aromáticos. Entre estos, la proteína transportacil (ACP), la estaroil desaturasa (SAD), la cetoacil-acp sintasa (KASs), la policetida sintasa tipo III (PKS III) y la ciclas(pks-ciclas) son enzimas clave que determinan la tasa y proporción de contenido de la síntesis de urushiol.

2.2.1 proteína transportadora de acilo (ACP)

La proteína transportadora de acilo (ACP) pertenece a la gran familia de proteínas transportadoras. Como una proteína mixta, se puede asociar con varios complejos proteína-enzima para transferir cadenas acilo de un sitio central de la enzima a otro. También actúa como un cofactor para la estaroil-acp desaturasa (SAD) y acil-acp hidrolasa (AAH), y juega un papel importante en la síntesis de ácidos grasos (FAS) y la síntesis de policetida (PKS) vías.

Li Mengjun et al. [43] analizaron la estructura de los genes de las proteínas portadoras de acilo en 17 especies, incluyendo Arabidopsis thaliana, Clycine max, Oryza Sativa.y Zea mays, y las clasificaron en cinco categorías. Entre ellos, la familia de genes ACP de tipo plasmedio (la región codificante consta de 4 exones y 3 intrones) y la familia de genes ACP de tipo mitocon(la región codificante consta de 2 exones y 1 intron) representan la mayor proporción del total. Ambos tienen un sitio serino muy conservado que puede unirse al 4' grupo cofactor -fosfofosfoteína aducto, y activar el holo-ACP para funcionar. La estructura tercide la familia de proteínas ACP es consistente y consiste de cuatro héhéconservadas. Tres de las hé− (I, II, IV) son paralelas entre sí, mientras que la hé− (III) es perpendicular al centro de la hé, formando una cavidad estructural hidrofóbica que proporciona una estructura hidrofóbica protectora para varias cadenas acilo [44].

La héα puede interactuar con la cetoacil-acp sinthase Ⅱ (-cetoacil-acp sinthase Ⅱ, KAS β) para extender aún más la cadena acilo, y es conocida como la héde reconocimiento. Singhal [38] realizó la secuencidel transcriptoma en geranios y examinó dos secuencias completas de cDNA de la proteína ACP (Pxh1 y Pxh2) relacionados con la síntesis de ácido urushiol. La verificación de la expresión génica y el análisis filogenético mostraron que los genes Pxh1 y Pxh2 estaban altamente expresados en el tejido tricomo de geranio, y son altamente homólogos al gen de la proteína de biosíntesis ACP del cilantro (Coriandrum sativum), que cataliza la desaturde de ácidos grasos en la vía del ácido urónico.

Cetoacil-acp sintasa (KASs)

Bajo la acción del complejo de ácidos grasos sintasa (FAS), malonil-acp se utiliza como sustrpara formar los precursores del ácido ginkgólico, ácido palmitoleico (− 9 C16:1) y ácido oleico (− 11 C18:1), a través de múltiples ciclos de condens. El complejo de ácidos grasos sintasa se compone de tres cetoacil-acp sintasa (KASs), que pertenecen a la superfamilia de cond-enzimas. Todas son lipoproteínas hidrofóbicque contienen el dominio estructural conservado KAS y ningún péptido señal. KAS III cataliza la polimeride malonil-coa y acetil-CoA para formar la cadena acilo inicial (3-cetobutiril-acp); KAS I cataliza la polimeride la cadena acilo y malonil-acp para formar ácidos grasos con 6C-16C; Y KAS II cataliza la condensde malonil-acp y ácido palmítico para formar ácidos grasos 18C.

En plantas como la perilla [45] y el algodón de tierras altas [46], KAS II es una proteína ligeramente ácida no secretada con una longitud de aminoácidos de aproximadamente 500 AA. Determina la relación de ácidos grasos C16:C18 y puede regular la resistencia al frío de la planta. Los investigadores han obtenido siete genes de cetoacil-acp sintasa (KASs) del transcriptoma de Pelargonium xanthium, de los cuales PxKASⅠa, PxKASⅠb y PxKASⅠ C tienen una expresión alta y estable en el tejido tricoma de Pelargonium xanthium, mientras que la expresión génica en otros tejidos es baja. El tratamiento posterior de tricomas con gradide temperatura (18, 23 y 28 °C) mostró que la expresión de los tres genes disminuyó con el aumento de la temperatura, y se correlacionpositivamente con el contenido de ácidos grasos (ácido palmitoleico (− 11 C16:1) y ácido oleico (− 13 C18:1)) y urushiol, o involucrados en la vía de síntesis de urushiol. El análisis evolutivo muestra que la familia de genes KAS del geranies altamente homóloga a los genes ketoacil sintasa (KAS) de Arabidopsis thailana y Glycine Max, y el mecanismo catalítico relacionado es relativamente claro. Senembargo, ha habido pocos estudios moleculares sobre el KAS de la ginkgolide cetoacil-acp sintasa (KAS). Cómo el precursor ácido palmitoleico (− 9 C16:1) y ácido oleico (− 11 C18:1) del ácido ginkgo (C15:1) y el ácido heptadecenoico (C17:1) son regulados por la familia ginkgo cetoacil-acp sinproporción como importantes ácidos grasos monoenriquinsaturados permanece por ser explorado en profundidad.

Desaturasa estaroil-acp (SAD)

La estaroil-acp desaturasa (SAD) es la única familia conocida de desaturasas solubles en plantas, que regula la proporción de ácidos grasos saturados a insaturados. Entre ellas, la estestaroil-acp desaturasa es la más estudien las plantas. Cataliza la deshidrogenación de las posiciones C9 y C10 de la cadena acilo para formar el primer doble enlace. La proteína SAD es un homodímero compuesto por un dominio conservado perteneciente a la familia de las desaturasas acil-acp y un dominio conservado perteneciente a la familia de las ferritinas. Las cuatro héen en la región conservsad forman una estructura de haz de cuatro hé, que oculta un centro catalítico de Fe-O-Fe de dos cústeres de hierro simétrico. Juntos, forman el centro activo de la enzima para la deshidrogenación de la cadena acilo [47]. La estructura cristalina de la proteína muestra que la enzima SAD tiene una profunda ranura que se extiende desde la superficie molecular hasta el interior, que puede acomodar la cadena de acilo 18C y unirse al centro ferroen la parte inferior de la ranura para sufrir reacciones redox. Esta estructura de ranura también puede acomodar las cadenas de acilo 16C y 14C para reaccionar, pero la tasa de recambio catalítico es baja [48].

Schultz et al. [41] examinaron una nueva acil-acp desaturasa de una biblioteca de cDNA de gerani. El alinede la secuencia géreveló un alto grado de homología con el gen de ricino stearoil-acp desaturasa (SAD). Los resultados de la transformación genética y la verificación usando Escherichia coli (E. coli) mostraron que el nuevo gen puede catalizar la deshidrogenación del ácido mirístico -ACP (C14:0) para formar ácido mirístico -ACP (− 9 C14:1), por lo que se le llama gen mirístico acido-acp desaturasa (MAD, − 9 14:0-ACP desaturasa). La detección de la expresión génica Singhal [38] y los resultados de la validación de la transformación genética del tabaco (Nicotiana tabacum) muestran que tetradecil-acp (− 9 C14:1), el producto catalizado por la ácido mirístic -ACP desaturasa (MAD), es un precursor clave de palmitoleica-acp (− 11 C16:1) y oleica-acp (− 13 C18:1). La actividad de la miristoil-acp desaturasa (MAD, − 9 14 − 0- ACP desaturasa) determina el contenido de palmitoil-acp (− 11 C16 − 1) y oleoil-acp (− 13 C18 − 1) mediante la detección de la actividad enzim, contenido de ácidos grasos y contenido de ácidos fenó, que a su vez regula el contenido de las dos cadenas laterales monoenilo, ácido oleico (C22:1 y C24:1). Además, Singhal [38] estableció un gradiente de temperatura (18, 23 y 28 °C) para investigar los cambios en la expresión de genes de enzimas relacionadas en el tejido del geraniumtrichome, y encontró que los niveles de expresión del gen de la desaturasa del ácido myristic (MAD, − 9 14 − 0- ACP desaturasa) y el gen stearoil-acp desaturasa (SAD, − 9 18 Δ La expresión de 0-ACP desaturasa) disminuyó con el aumento de la temperatura.

Wang et al. [49] clonaron un gen stearoil-acp desaturasa (SAD, − 9 18:0-ACP desaturasa) del cDNA de la hoja de Ginkgo biloba y somelas hojas de Ginkgo biloba a estrés de temperatura (4, 15 y 45 Δ C). Los resultados mostraron que la expresión génica fue alta a bajas temperaturas (4 °C) y temperatura ambiente (15 °C), mientras que la expresión génica a altas temperaturas (45 ℃) fue varias veces menor que la del grupo control. Posteriormente, Liu Xinliang et al. [50] mostraron que el gen GbSAD codifica una cadena peptídica con una longitud de cadena de 412 AA y un peso molecular de 47 kDa. El análisis de conglomerados mostró un alto grado de similitud con las secuencias de aminoácidos estaroil-acp desaturasa (SAD) de otras gimnospermas. Los experimentos con hormonas exógenas mostraron que la expresión del gen GbSAD no estaba regulada por el ácido abscísico (ABA), el metiljasmonato (MeJA) o el etileno (ETH), sino que el ácido salicílico (SA) activaba la expresión génica, con un valor de expresión más alto de 9,7 veces el del grupo de control, lo que indica que el SA puede estar involucrado en la regulación de la vía de síntesis de ácidos grasos.

Pelargonium graveolens y Ginkgo biloba contienen el único ácido mirístico-acp desaturasa (MAD, − 9 14 − 0-ACP desaturasa) y ácido esteári-acp desaturasa (GbSAD, − 9 18 − 0-ACP desaturasa), respectivamente. Ambas enzimas son sensibles a la temperatura y altamente activas a bajas temperaturas. Ambas enzimas son las únicas desaturasas soluen agua en las plantas y tienen un alto grado de similitud en términos de su estructura funcional. Por lo tanto, la verificación de la función homóde la desaturasa de ginkgo stearoil-acp (GbSAD, − 9 18:0-ACP desaturasa) aclarará aún más el mecanismo de la síntesis de ácido de ginkgolida.

2.2.4 poliketide sintasa de tipo III (PKS III)

Las sintasas de policetida se dividen en tres categorías: − PKS I, conocido como PKS modular, está compuesto de varios polipéptidos multifuncionales, cada uno de los cuales lleva un dominio catalítico único, no reutiliz. PKS II, también conocido como PKS iterativo o PKS aromático, es un sistema iterativo de un complejo multienzimque utiliza un conjunto de dominios reutilizpara catalizar la formación de estructuras policetónicas de fenol múltiples veces durante pasos de reacción repetidos. − PKS III, conocida como la enzima tipo sintasa de chalcone, es completamente diferente de los dos primeros tipos de familias de enzimas PKS. Puede reutilizar proteínas bifuncionales homólogas, no depende de la activación de ACP y su sitio activo 4' -fosfofosfoteína sulfur, y no necesita activar el sustracil-coa a través de ACP para reaccionar directamente con acil-coa. Aunque los mecanismos estructurales de los diferentes tipos de PKS son diferentes, todos ellos utilizan el dominio de la cetosintasa (KS) o subunidad para catalizar la formación de enlaces C-C, que descarboxilato y condense acil-coa para extender la cadena de carbono.

La familia PKS III es muy diversa. La sintasa de chalcona (CHS) y la sintasa de stilbene (STS) son las dos familias más antiguas descubiertas y más representativas. Sus secuencias de aminoácidos son 60% a 75% similares [42]. La familia de la sintasa chalcone (CHS) se encuentra ampliamente en las plantas. Es una proteína homodimérica con un peso molecular de 40-45 kDa. Usando un centro activo altamente conservado (una combinación de cyhis-asn), cataliza la elongde la cadena de carbono de la cumarina CoA usando tres sustrde piruvatocoa para formar una estructura de anillo intermedio de tetrapéptido [42,51-52]. El ion hidrógeno C6 del anillo intermedio tetrapéptido sufre una reacción de condensde Claisen con el grupo C1 cetona para formar un anillo de carbono hexa miembros, que luego se aromatipara formar una difenilcetona, también conocida como chalcon (figura 5). Chalcone es un precursor importante para la síntesis de flavonoides. La enzima stilbeno sintasa (STS) se ha descrito en plantas y microorganismos (por ejemplo, Streptomyces, levadura y bacterias). Tiene un peso molecular de aproximadamente 43 kDa, es un dímero que consta de 2 subunidades, y tiene una proteína con un dominio específico conservado IPNS(F) AGAIAGN, que es altamente homóloga a la chalcone sintasa (CHS) [53].

La enzima STS utiliza coumaroil CoA como sustrpara formar una estructura de anillo intermedio tetrapéptido. El grupo C7 cetona del anillo intermedio tetrapéptido sufre una reacción de condensación aldólica con el ion hidrógeno C2 para formar un anillo de carbono de seis miembros, y luego aromatipara formar la fitoalexenresveratrol glucósido [54] (figura 5). Singhal [38] identificó una cetoacil CoA sintasa tipo 2 (KCS2, ceto-acil CoA sintasa 2) en gerani(Pelargonium hortorum), su estructura espacial tercies similar a la de policetida sintasa tipo III (PKS III), Y se especula que está involucrado en la reacción de condensación por ciclización en la vía de síntesis del urushiol. La cetoacil CoA sintasa (KCS) es una enzima limitante de la velocidad que cataliza la primera reacción de condensen la síntesis de ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFAs). La investigación sobre su familia génica se ha centrado principalmente en la planta modelo Arabidopsis thaliana, y hay pocos informes de investigación en otras plantas. Costaglioli et al. [55] clasificaron los 21 miembros del gen KCS en Arabidopsis en cuatro subgrupos (FAE1, KCS1, FDHy CER6) con base en la homología génica y el análisis de la evolución genética. Entre ellos, el gen FAE1 fue el primer gen de la familia KCS clonado por James et al. [56] usando el método de marcado transposon. La secuencia de aminoácidos de FAE1 es altamente homóa otras sintasa policetida (chalcone sintasa (CHS), squalene sintasa (STS), y tipo III cetoacil-acp sintasa (KAS III)).

La cetol-acil CoA sintasa (KCS) de diferentes especies tiene diferentes especificidades de sustr. Ginkgolide A pertenece A la Sustancias ácidas de laca Y su poliketide sintasa de tipo específico de camino III (PKS III) es similar en términos de su estructura funcional a geranium's tipo 2 ceto-acil CoA sintasa (ceto-acil CoA sintasa 2). Además, la policetida sintasa de la ruta del ácido urushiol y la acitransferasa (STS) reconocen el grupo C7 cetona en el anillo intermedio tetrapéptido y el ión de hidrógeno C2 para someterse a una reacción de condensación aldólica para formar un anillo de carbono hexa miembros. La diferencia es que la aciltransferasa (STS) sufre una reacción de descarboxilación durante la reacción de ciclde condensaldólica, que oxiel grupo cetona en la posición C1 para liberar dióxido de carbono, sin embargo, durante la ciclación de policetida del ácido lactónico, el grupo C1 cetona se retiene, yla estructura del ácido benzoico se forma por la sustitución de CoA con un ion hidrógeno (H+). El mecanismo catalítico actual aún no está claro y requiere más investigación.

2.2.5 policetida ciclas(pks-ciclas)

El ácido 2,4-dihidroxi6-pentilbenzoico (ácido olivetólico), también conocido como ácido olivetólico, es un importante precursor para la síntesis de cannabinoides. Gagne et al. [57] encontraron que el hexanoil-coa es catalizado por la PKS III (TKS) de cannabis para sintetizar una estructura de anillo intermedio tetrapéptido que contiene 12 carbonos. Si la enzima TKS continúa catalizando, la cadena acilo se condensa y se cicliza en las posiciones C2 y C7, liberando CO2 para formar 3,5-dihidroxipentilbenceno (Olivetol); Mientras que la reacción de condensy ciclación catalizada por la ciclaspks (ácido olivetolico cy- classe, OAC) cataliza una reacción de condensque retiene el grupo C1 carboxilo para producir ácido 2,4-dihidroxi6-pentilbenzoico (ácido olivetolico). El análisis de función proteica muestra que la enzima OAC contiene una topoúnica β-α- - - - - - - - - - - - - y puede catalizar la cicdel grupo acilo en las posiciones C2 y C7 y retener el grupo carboxilo.

OAC es una nueva proteína funcional que contiene un dominio dimérico − + − barril (proteína dimérica − + − barril, DABB), que se encuentra principalmente en bacterias, hongos y plantas. Con la excepción de la ciclascsoac del ácido canabidióde Cannabissativa, las proteínas similares a la dabb vegetal son principalmente de la familia de las proteínas termoestables (HS) y son muy similares en estructura a las ciclasde policetida de las especies de Streptomyces [58]. La proteína DABB es una proteína pequeña (12 kDa, 101 AA) que se encuentra en el citoplasma con la PKS III, juega un papel similar a la chaperona al guiar el plegdel producto intermedio tetrapéptido, y finalmente forma una sustancia que contiene una estructura de ácido benzoico. La investigación de Gagne et al. [51] retuvo el grupo C1 cetona para la ciclación de policetida de la síntesis de ácido lacónico, proporcionando nuevas referencias e ideas para el proceso catalítico de la formación de ácido benzoico.

3 perspectivas

En la década de 1960, los ginkgolifueron identificados como una de las sustancias activas en la capa exterior de la semilla de ginkgo. Con la popularización de la tecnología de cromatografía líquida de alto rendimiento de espectrometría de masas (HPLC-MS/MS) y la mejora de la precisión de detección de RMN (tecnología de resonancia magnética nuclear), ahora es posible aislar e identificar los cinco ácidos de ginkgo comunes y cuatro ginkgolidos de tejidos tales como hojas de ginkgo y frutos. Los ginkgolidos son lacas y tienen propiedades polares únicas (hidrofóbicas e hidrofílicas), que han llevado a su uso en muchos campos como la medicina, productos químicos, belleza y controlde plagas. En particular, el ácido ginkgólico (C15:1) se ha demostrado por Fukuda et al. [59] para prevenir la acilación de pequeñas proteínas modificadoras relacionadas con la ubiquitina (SUMO) para regular las funciones celulares relacionadas. Se considera un medicamento potencial para el tratamiento del cáncer y enfermedades neurológicas y es digno de investigación y desarrollo.

Además del ginkgo, los ácidos urushiol también han sido aislados e identificados en cultivos comerciales como el árbol de Marañón (C. equatorialis), zumaque, pistachos y geranios. Schultz et al. [60] llevaron a cabo experimentos sobre la síntesis del ácido urushiol. Los resultados mostraron que el ácido cítrico marcado con 14c, propionil-coa, oleoil-coa, ácido acético, ácido mirístico y ácido palmítico fueron incubcon células de tricomas de Pelargonium graveolens. Solo la oleoil-coa (C18:1) se encontró involucrada en la síntesis de Urushiol como una fuente de carbono eficaz, mientras que las otras sustancias tendían a sintetizar triacilglicerol para formar lípidos de almacenamiento. Por lo tanto, la palmitoleoil-coa (C16:1) y la oleoil-coa (C18:1) se han identificado como precursores importantes para el estudio de la síntesis de ácido lacosana. Sin embargo, la ginkgolide, como una fitoalexina única al ginkgo, tiene una vía de síntesis y regulación molecular evolutiva especial y conservada. En la actualidad, la investigación sobre la regulación de la síntesis de ginkgolida se centra principalmente en el transcriptolipídico y el análisis metabolómico, mientras que hay pocos informes sobre la exploración del mecanismo de síntesis de poliquetida y la clonación de genes relacionados, por lo que se necesita más investigación.

Los factores de transcripción MYB y WRKY pueden regular la expresión de los miembros de la poliketide sintasa de tipo III (PKS III) de la familia, afectando los cambios en el contenido de metabolisecundarios con efectos de resistencia. La enzima limitante clave en la síntesis de ácido de laca es una policetida sintasa de tipo III (PKS III) que es altamente homóa la cetoacil CoA sintasa (KCS). Eckermann et al. [61] encontraron que el herbimetazaclorpuede inactivar la enzima limitante de la tasa (ketolacton CoA sintasa (KCS)) en la síntesis de ácidos grasos de cadena muy larga (VLFAS), así como la chalcone sintasa (CHS) y squalene sintasa (STS) de la poliketida sintasa de la familia III. Cloroacetamida metazacaclor puede unirse a la cisteína en el sitio clave de la enzima relevante, evitando que la reacción de condensse produzca normalmente. En el futuro, la sustancia química será verificada utilizando una línea celular de suspensión de ginkgo para determinar si también puede inactivar la policetida sintasa de tipo III (PKS III) que sinteel ácido lacónico. Esto proporcionará una mayor comprensión de la función catalítica y el mecanismo regulador de la policetida sintasa de tipo III (PKS III) en la síntesis de ácido lacónico. La progresiva elucide estos mecanismos reguladores proporcionará orientación teórica y práctica para el cultivo de líneas celulares con bajo o alto rendimiento de ácidos fenólicos.

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