¿Cómo producir edulcorxilitol en polvo por método de fermentación?

1 introducción

El xilitol tiene un amplio espacio de mercado en los campos de lunalimentación, lunmedicinuny otrasáreas, y existe un enorme potencial de desarrollo [1-3]. En la actualidad, la producción de xilitol por biofermentación es una nueva forma verde y económica de producir xilitol. La producción de xilitol por biofermentación evita reacciones químicas violentas, no requiere equipos y catalizadores de alta temperatura y alta presión, y debido a la especificidad de las cepas, especificidad enzim, y la singularidad de la conversión y otras características, de modo que la producción de xilitol por biofermentación tiene protección ambiental, ahorro de energía, alta eficiencia y muchas otras ventajas, y tiene un gran potencial para el desarrollo industrial, Que ha sido ampliamente investigado y prestado atención por investigadores nacionales y extranjeros [4,5].

aunqueProducción de xilitol por fermentación microbianaTiene un amplio desarrollo y perspectivas de aplicación, todavía hay un montón de problemas que necesitan ser resueltos durante la investigación actual y la industrialización: cómo obtener cepas de fermentación de alto rendimiento, cómo estabilizar y mejorar el rendimiento a través del control integral de fermentación, y cómo promover aún más el proceso de industrialización [6]. Por lo tanto, la investigación actual sobre la producción de xilitol por fermentación microbiana incluye el estudio del rendimiento de la fermentación de diferentes cepas productoras de xilitol, la preparación del hidrolisado de hemicelulcomo sustrde fermentación, la desintoxicación y las condiciones de fermentación, así como el uso de la tecnología de inmovilización para lograr la fermentación multilote [7]. En este trabajo nos centraremos en los principales avances de la investigación en la producción de xilitol por bioprocesamiento.

2 microorganismos para la producción de xilitol por fermentación

2.1 fermentación del xilitol por microorganismos naturales

En la producción de fermentación industrial, el rendimiento de la fermentación de las cepas está directamente relacionado cella capacidad de producción del metabolismo microbiano, el coste de la producción de fermentación y la dificultad de la producción a escala industriAl.Actualmente, la conversión xilose/xilitol y el rendimiento de xilitol siguen siendo uno de los cuellos de botella que limitan la ampliación de la producción de xilitol por conversión microbiana, por lo que es particularmente importante obtener una cepa de xilitol de alto rendimiento celexcelente rendimiento [8].

Hay muchas eespeciede microorganismos que pueden utilizar xilosa para producir xilitol a través de diferentes rutas metabólicas, incluyendo un pequeño número de bacterias, algunos mohos, y la mayoría de las levaduras [2]. Senembargo, se ha informado que la mayoría de los microorganismos producen xilitol a bajas tasas de conversión por fermentación. Aunque los hongos pueden producir xilitol a través de la ruta xilosa − xilululosa − xilitol, la eficiencia de producción de los hongos es generalmente baja [9]. A través de un análisesexhaustivo, se encuentra que las levaduras, especialmente Pseudomallei, tienen un rendimiento superior en la fermentación de xilitol, y su rendimiento máximo puede alcanzar el 84.5% del valor teórico, por lo que la mayor parte de la investigación actual nacional e internacional se centra en el uso de la levadura para convertir la xilosa en xilitol [10,11].

2.2 construcción de cepas genéticamente modificadas para la producción de xilitol por fermentación

Celel rápido desarrollo de la tecnología de ingeniería genética en los últimos años, algunos investigadores han obtenido cepas de alto rendimiento mediante el cribado, clonación y medios transgénicos de la naturaleza. E.coli es considerada como la primera opción de bacterias genéticamente modificadas para la producción de xilitol debido a sus ventajas de fácil regulación, fácil cultivo, y fondo metabólico claro [12]. Se ha demostrado que el xilitol puede ser detectado después de la fermentación mediante la introducción del gen xilosa-reductasa en las células de E. coli. Senembargo, sólo la xilosa reductasa introducida en E. coli todavía tiene ciertos defectos, como la especificidad de la xilosa reductasa (XR) es relativamente pobre, puede catalizar tanto la xilosa como la conversión de arabinosa. El arabinitol y xilitol generados a partir de la arabinosa selisómeros diferenciales, y ambos tienen propiedades físicoquímicas extremadamente similares, lo que aumenta las dificultades para la posterior separación y purificación [13]. Por lo tanto, algunos investigadores introdujerelel gen xilosa isomerasa y el gen xilitol reductasa en E. coli, y utilizarella xilulosa como el producto intermedio de la conversión de xilosa para producir xilitol.

Como se muestra en la Fig. 1, la ruta metabólica de xilosa se puede ver que la xilosa es isomeria xilulosa por la xilosa isomerasa (XI), y luego xilitol es producido por xilitol reductasa. La construcción de esta vía puede efectivamente evitar el problema de la inespecificidad catalítica de la XR,que es una nueva vía para la producción de xilitol [14]. Además, la introducción del gen de la l-arabinosa isomerasa, el gen de la aloxanosa isomerasa y el gen de la xilulosa reductasa en E. coli no sólo construyó una nueva ruta metabólica de la l-arabinosa al xilitol, sino que también eliminó la interferencia del arabinitol, que también es muy favorable[15]. Wang WangWangWangWangWangXiaoxia etal [16]a través del gen xilanasa (xina) y del gen xilose reductasa (xyl1) en Escherichia coli e indujo su coexpresión encontró que aunque la actividad enzimde las dos enzimas es más baja que la actividad enzimde la expresión separada, pero se ha demostrado que es capaz de directamente de las materias primas lignocelulósicas para la preparación de xilitol por fermentación, no tienen que derivarse del hidrolisado hemicelulósico, Que es también una nueva vía a abrir para la producción de xilitol bioproceso. Esto también abre una nueva vía para la producción biológica de xilitol.

En la actualidad, no sólo la E. coli se utiliza como un portador de bacterias de ingeniería genética, sino también la levadura se utiliza a menudo como un importante microorganismo industriAl.Saccharomycescerevisiaees uno de los objetivos de investigación clave para los vectores de ingeniería genética debido a su alta tolerancia a algunos inhibidores del crecimiento, crecimiento rápido y subproductos bajos [17,18]. Como se muestra en la figura 1, el metabolismo de la xilosa en las células de levadura es catalizado por la xilosa reductasa. Sin embargo, debido a la falta de enzimas relacionadas con la xilosa, Saccharomycescerevisiaees incapaz de utilizar xilosa en condiciones naturales y sólo puede utilizar glucosa como una fuente de carbono y energía para el crecimiento y el metabolismo [19]. Por lo tanto, la introducción del gen xilose reductasa (xyl1) en Saccharomyces cerevisiaey su expresión eficiente son los primeros prerrequisitos para la construcción de cepas productoras de xilitol.

LietAl.[20]introdujeron el gen de la xilosa-reductasa de Saccharomyces cerevisiae en Saccharomyces cerevisiae y obtuvieron la cepa XGH2 recombinante de Saccharomyces cerevisiae que contenía una copia alta del gen de la xilosa-reductasa, lo que aumentó la actividad de la xilosa-reductasa en 80 veces en comparación con la cepa iniciAl.Debido a la falta de xilitol deshidrogenasa en las bacterias recombinantes, la tasa de conversión de xilosa de esta cepa recombines superior a 1.0 g/g, lo que tiene un gran potencial para la industrialización.

3 producción de xilitol por fermentación de hidrolisado de hemicelulosa

El uso de xilosa pura como materia prima para elProducción de xilitolPor método biológico tiene un alto costo de producción, lo que limita el campo de aplicación y el espacio de mercado del xilitol. En la naturaleza, fibras de plantas como mazde de maíz, bagazo y cáscara de semilla de algodón contienen una gran cantidad de xilosa, que puede ser hidrolizy utilizada como sustrde de fermentación para la producción de xilitol [21,22]. La sustitución de xilosa pura con fibras vegetales que existen en grandes cantidades y pueden ser regenerde manera sostenible como materia prima puede reducir eficazmente los costos de producción y realizar el uso pleno de los recursos naturales.

3.1 preparación de hidrolisado de hemicelulosa

Con el fin de promover la industrialización de la producción de xilitol por método biológico, es muy necesario encontrar un método de hidrólisis de alta calidad y eficiente. La preparación del hidrolisado de hemicelulosa tiene principalmente dos tipos de método químico y método enzim. El ácido sulfúrico diluido y el ácido clorhídrico se utilizan comúnmente como catalizadores en el método químico [23]. Aunque el uso de ácido diluido puede reducir el contenido de sustancias tóxicas en comparación con la hidrólibajo condiciones ácidas fuertes, una gran cantidad de oligosacáridos no fermentables permanecen en el caldo de fermentación, resultando en un gran desperdi. Al mismo tiempo, la hidrólisis ácida diluida todavía inhiel el crecimiento de las células de levadura y la conversión de xilosa, resultando en un menor rendimiento de xilitol y una mayor concentración de azúcar residual [24].

Con el fin de reducir los efectos secundarios de la hidrólisis ácida, es posible aliviarlos mediante el uso de medios mecánicos, por ejemplo, Zheng Shenghong etal [21]utilizaron ondas ultrasónicas y ácido para hidrolizar la cáscara de las semillas de té a presión atmosférica para preparar xilosa, y utilizaron una pequeña cantidad de ácido para obtener una alta concentración de xilosa. Además, se encontró que el rendimiento de la fermentación del xilitol producido por fermentación enzimno era tan bueno como el de la xilosa pura, pero significativamente mejor que el de la fermentación hidrolizada ácida [25].

En el caso de los granos de maíz, la xilanasa se utiliza a menudo para hidrolizar los granos. Existen dos tipos de hidrólisis: la hidrólienzimdirecta del maíz y la hidrólienzimdel maíz [26]. Dado que las nueces de maíz son ricas en celuly lignina, el área de contacto entre xilanasa y hemicelulosa en la hidrólisis enzimdirecta de las nueces de maíz es pequeña, resultando en una baja tasa de hidrólienzim. Aunque la lignina en el grano de maíz se puede eliminar de antemano por pretratamiento, la celulresidual todavía dificulta la hidrólienzimdel xilano [27]. Por lo tanto, Dámaso etal.[28]obtuvieron un rendimiento máximo de 0.52 g/g de xilosa de granos de maíz utilizando xilanasa.

Los investigadores mezaron celulasa y xillanasa para hidrolizar los granos de maíz pretratados, aunque podría aumentar la tasa de hidrólisis de xilan, pero la gran cantidad de glucosa producida por la hidrólisis de celulpodría inhibir la actividad de la xilosa reductasa, y causar que la levadura produzca etanol a través de la respiración anaeróbica, lo que finalmente condujo a una disminución en la producción de xilitol [29]. Por el contrario, el autohidrolizado de grano de maíz contiene principalmente xilano-oligosacáridos, y no se puede producir una gran cantidad de glucosa mediante el uso de una única xilanasa o mezclcon celulasa, y el xilano en el autohidrolizado de grano de maíz es más fácilmente catalizado por xilanasa, que no sólo puede aumentar la velocidad de hidrólisis y acortar el tiempo de hidróli, sino también reducir la cantidad de enzima utilizada [30]. Se puede observar que el uso de diferentes métodos de hidróliproducirá diferente calidad de hidrolisado de hemicelulosa, lo cual tendrá diferentes efectos sobre la fermentación de xilitol.

3.2 tratamiento del hidrolisado de hemicelulosa

La concentración de xilosa en el hidrolisado hemicelulósico del grano de maíz tendrá un efecto importante en la eficiencia y rendimiento de la fermentación, por lo que la obtención de hidrolisado hemicelulósico con alta concentración de xilosa es un requisito previo importante para asegurar el rendimiento de xilitol. Al mismo tiempo, el hidrolisado hemicelulósico se compone de componentes complejos y una variedad de especies. En particular, no deben subestimarse los efectos de sustancias tóxicas como el ácido acético, el furfural y los taninos sobre la fermentación [31,32]. Por lo tanto, antes de la fermentación del hidrolisado hemicelulósico, el hidrolisado debe ser desintoxicprimero, lo que afecta directamente el rendimiento de la fermentación de la hemicelulosa. Los métodos de desintoxicación del hidrolisado hemicelulósico incluyen principalmente evaporal vacío, neutrde cal, neutrde cal, adsorde carbón activo, adsorde resina de intercambio iónico, y evapora baja temperatura y concentración [33,34].

Entre ellos, la neutralización de la cal y la cal sobre neutralización son los métodos de desintoxicación más industrializados, pero una gran cantidad de azúcar se produce a menudo en el proyecto de desintoxicación, lo que disminuye el rendimiento de fermentación de xilitol, y al mismo tiempo, el yeso producido en el proceso de neutralización requiere una serie de equipos de seguimiento y medios de tratamiento, lo que aumenta el costo de producción [32]; La adsorde carbón activado tiene un mejor efecto de desintoxicación, pero al mismo tiempo, también adsoruna gran cantidad de xilosa, que no es conducente a la mejora del rendimiento de xilitol; El uso de la concentración de vacío no sólo puede aumentar el efecto de desintoxicación, sino también adsoruna gran cantidad de xilosa, por lo que no es beneficioso para la mejora de la producción de xilitol. La concentración al vacío no sólo puede mejorar la concentración de xilosa en el hidrolizado, sino también eliminar la mayor parte del furfural, el ácido acético y algunos componentes tóxicos volátiles [35].

Sin embargo, la selección de la relación de concentración adecuada es crucial para la concentración de vacío, y ni demasiado alto ni demasiado bajo puede lograr una desintoxicación racional [33]. Aunque cada método de desintoxicación tiene sus propias características, el uso combinado de múltiples métodos de desintoxicación para tratar el líquido hidrolizado en pasos puede lograr buenos resultados. Al combinar la adsordel carbón activo con la resina de intercambio iónico, los investigadores encontraron que el efecto de desintoxicación era mejor que el del exceso de cal [36]. Martínez etal.[37]lograron un rendimiento de 79% de xilitol por neutrde cal seguido de tratamiento con una pequeña cantidad de carbón activo. Por lo tanto, la combinación de múltiples métodos de desintoxicación es una forma importante de producir hidrolisado de hemicelulosa de alta calidad.

3.3 optimización de las condiciones de fermentación con hidrolisado de hemicelulosa como sustr.

En la fermentación de xilitol usando hidrolisado de hemicelulosa como sustr, diferentes condiciones de fermentación afectan el grado de conversión de xilosa a xilitol, incluyendo sustr, temperatura, pH, iones inorgánicos, aireación, y modo de fermentación [38,39]. Estas condiciones incluyen sustr, temperatura, pH, iones inorgánicos, aireación y método de fermentación [38,39]. La regulación de estas condiciones puede mejorar aún más el rendimiento de fermentación de las bacterias. Entre estas condiciones, el sustry la aireación son particularmente importantes.

La concentración de xilosa en el hidrolizado de hemicelulosa tiene un efecto significativo en la producción de xilitol. Se demostró que la tasa de consumo de xilosa y la tasa de producción de xilitol en el proceso de fermentación estaban correlacionadas positivamente, por lo que la concentración de xilosa en el hidrolizado podría aumentar la tasa de producción de xilitol efectivamente [40]. Sin embargo, exceder un cierto rango también inhiel crecimiento y el metabolismo de las bacterias, lo que resulta en una disminución en la producción de xilitol, por lo que la optimización de la concentración de xilita en la solución de hidrólisis es un factor regulador importante para mejorar la tasa de producción de xilitol [38]. En general, la concentración inicial de xilosa de la mayoría de las levaduras es baja, pero hay algunas levlevaduras tolerantes al azúcar cuya concentración inicial adecuada de xilosa puede alcanzar los 100 g/L [41].

Además, otros azúcares como la glucosa, la manosa, la galactosa y la arabinosa también están presentes en el hidrolisado de la hemicelulosa [39]. Debido ala pequeña cantidad de manosa, galactosa y arabinosa en el hidrolizado, las bacterias no son muy sensibles a ellos, por lo que tienen poco efecto sobre la fermentación de xilitol [42]. Aunque la presencia de glucosa puede ser utilizada preferentemente por las bacterias para su propio crecimiento y metabolismo para evitar el consumo inútil de xilose, la diferencia en la proporción de glucosa en el hidrolizado no sólo conducirá a un cambio en el potencial de oxid- reducción, que afectará a las actividades y proporciones de las enzimas relacionadas con el metabolismo de xilose, pero también producir efectos metabólicos disuasorios que pueden inhibir seriamente la vía de la fermentación de xilitol [32]. Además, las concentraciones de glucosa por encima de un cierto rango puede hacer que las bacterias para producir un cierto volumen de etanol que es inhibitde la fermentación de xilitol [37]. Por lo tanto, es necesario optimizar y obtener la concentración de azúcar adecuada para el crecimiento y metabolismo de las bacterias y la fermentación de xilitol.

En la fase temprana de la fermentación, el aumento suficiente de oxígeno disuelto en el substrato puede, por una parte, conducir al rápido crecimiento de las bacterias y reducir la producción de subproductos que son desfavorables para la fermentación del xilitol, como el etanol; Por otro lado, puede conducir al consumo de ácido acético, furfural y otros inhibidores para acortar el período de estancamiento [43]. Sin embargo, bajo oxígeno suficientemente disuelto, el NADH producido por xilitol deshidrogenasa es oxide de nuevo a NAD+ por la cadena respir, lo que conduce a una mayor oxidy deshidrogende xilitol para formar xilulosa. Por lo tanto, el xilitol sólo puede ser acumulado en grandes cantidades bajo condiciones estrictamente limitadas de suministro de oxígeno, y la selección de diferentes estrategias de aireación y fermentación tiene una gran influencia en la producción de xilitol [44]. Con el fin de resolver el problema anterior, algunos investigadores han investigado la fermentación de xilitol bajo diferentes tasas de aireación y luego seleccionuna tasa de aireación moderada para la fermentación aeróbica constante, que es simple, pero mal regulada para la fermentación de xilitol y desfavorable a la acumulación del producto [41].

Otros investigadores han adoptado la estrategia de alta y luego baja fermentación aeróbica: el uso de alta tasa aeróbica al comienzo de la fermentación para hacer que las bacterias crecen mucho, y luego reducir la tasa aeróbica en consecuencia para asegurar la acumulación de xilitol. PreziosiBlloy etal [45] lograron 80% de conversión de xilosa en hidrolizado de hemicelulosa de Candia uilliermondii usando alta y luego baja oxigenparciAl.Además, Wang etal [46]utilizaron una estrategia de tres pasos de oxigenen la fermentación de xilitol con hidrolisado de hemicelulosa como sustr, es decir, en primer lugar, una alta aireación para hacer que las bacterias se multipli; Después de que las bacterias alcanzaron una cierta concentración, mantuvieron una aireación del medio por un corto tiempo para hacer que las bacterias se adapt, y luego continuaron bajando la aireación para asegurar la acumulación de xilitol, y la producción de xilitol fue mejorada aún más por la aplicación de esta estrategia.

4 aplicación de inmovilización en la fermentación de la producción de xilitol

Actualmente, el uso de la tecnología de inmovilización para la fermentación de xilitol es también una dirección de desarrollo prometedor. En comparación con la fermentación libre, la fermentación celular inmoviliztiene las ventajas de reutilización, acortando el ciclo de producción de la fermentación, facilitando la separación, purificación y post-procesamiento del producto, alta densidad celular, alta estabilidad y fuerte resistencia a ácidos, álcalos y cambios de temperatura [47,48]. Por lo tanto, tiene un importante valor para la investigación y un valor económico. La inmovilización de las células puede mejorar la estabilidad de la fermentación y aumentar significativamente la eficiencia de la fermentación, además de realizar una fermentación continua multibatch, tales como: Prakash etal [49]inmovilizd. competenciacon alginato de calcio a una concentración inicial de xiosa de 100 g/L,y la tasa de conversión de xilitol alcanzó 0.82 g/g y se mantuvo al 98% del valor teórico durante cinco lotes consecutivos de fermentación. La conversión de xilitol se mantuvo al 98% del valor teórico en cinco lotes de fermentación consecutivos.

La clave de la tecnología de inmovilización celular radica en el rendimiento de los portadores inmovilizados, y los portadores de alta calidad tienen las ventajas de no toxicidad, buena transferencia de masa, bajo precio y larga vida [50]. En la fermentación inmoviliz, se requieren diferentes métodos de inmovilización dependiendo de los tipos de células y características [51]. Los portadores compuestos formados por la combinación de materiales inorgánicos y orgánicos se han convertido en un tema de investigación en los últimos años debido a las ventajas de ambos materiales.

Deng Lihong et Al.[52]encontraron que la concentración de masa de PVA afectó en gran medida la resistencia al fosfato y la resistencia mecánica de las partículas celulares, que fue crucial para regular el rendimiento del portador compuesto cuando el alcohol polivinílico (PVA) y el alginato de sodio se utilizaron para la absorción de compuestos de células Pseudohyphae tropicalis. Los cuatro métodos de inmovilización comúnmente utilizados son adsorción, método covalente, método de reticuly método de incrust[53]. Por ejemplo, Li et al.[18]utilizaron el método de incrustde gel de alginato de calcio para inmovilizar la doble coenzima dependiente de la levadura de Pasteur Picchu X-33 obtenida por clonación, y la tasa de conversión de xilitol fue de 37,5% después de la fermentación de xilo. Wang et al.[53]inmovilizaron la levadura tropical Pseudohyphomyces por poliuretano, que se hidrolizó en grano de maíz sin decoloración e intercambio iónico. Wang et Al.[53] utilizaron poliuretano para inmovilizar Pseudomonas tropicalispara convertir directamente xilosa en hidrolizado de grano de maíz sin decoloración e intercambio iónico, y el rendimiento y tasa de producción de xilitol alcanzó el 71,2% y 2,10 g/(L-h), respectivamente, en 12 lotes de 21 días de pruebas de fermentación, que es un método de inmovilización con gran potencial para el desarrollo industrial.

5 resumen

La producción de xilitol por biofermentación tiene ventajas irremplazables y un gran potencial de desarrollo. En este trabajo, hemos resumido los tres aspectos de la producción de cepas de xilitol, la fermentación de xilitol utilizando hidrolisado de hemicelulosa como sustr, y la aplicación de la tecnología de inmovilización en xilitol. También se destacan las principales líneas de investigación de la producción de xilitol por bioprocesamiento, es decir, el uso de tecnología de ingeniería genética, la construcción de bacterias genéticamente modificadas con alta eficiencia y alto rendimiento mediante modificación genética, el uso de hidrolisado hemicelulósico como sustrpara la fermentación de xilitol, y el uso de tecnología de inmovilización, Que utiliza diferentes medios de fijación y métodos de fijación para mejorar la eficiencia de la fermentación y la tasa de producción. Se cree que con la profundización gradual de estas líneas de investigación, el proceso de bioproducción de xilitol se volverá más maduro, sentando una cierta base para la industrialización de la bioproducción de xilitol en el futuro.

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