¿Cómo producir polvo de ácido hialurónico por el método de fermentación?

Ácido hialurónico (HA)Es un polisacárido macromolecular que fue aislado por primera vez y puridel humor vítredel del ganado vacuno por Meyer y otros en 1934, de ahí su otro nombre, hyaluronan [1]. El ácido hialurónico es un polisacárido de glucosamina lineal de repetición homogénea compuesto de 2.000 a 25.000 disacáridos de ácido glucurónico y n-acetilglucosamina Unidos alternativamente por enlaces glicosídicos − 1,3 y enlaces glicosídicos − 1,4 [2].

El ácido hialurónico es un componente importante de la matriz extracelular (ECM) [1]. Estudios recientes han demostrado que el ácido hialurónico no solo está ampliamente presente en la matriz extracelular entre células, sino que también existe dentro de la célula, concentrado principalmente en el citoplasma y núcleo de las células recién nacidas [2]. Además de encontrarse en el cuerpo vítreo, el ácido hialurónico también es abundante en el líquido sinovial de las articulaciones y en los espacios entre las células epidérmicas. En términos de cantidad, más del 50% del ácido hialurónico se encuentra en la dermis y epiderde de la piel, y alrededor del 35% se encuentra en los músculos y los huesos. Actualmente se cree queÁcido hialurónicoSe encuentra principalmente en el relleno del espacio inerte del tejido conectivo blando, y juega un papel importante en la formación de complejos proteoglicanos [2].

1 propiedades del ácido hialurónico

Bajo el microscopio electrónico,Moléculas de ácido hialurónicoSe observa que tienen una estructura lineal de cadena simple, y se expanden en una estructura de bobina aleatoria en una solución acuosa, con un diámetro de bobina de aproximadamente 500 nm. Cada unidad de disacárido en la molécula de ácido hialurónico contiene un grupo carboxilo, que puede disocibajo condiciones fisiológicas para formar un anión. La repulmutua entre los aniones a iguales distancias espaciales hace que la molécula esté en un estado extendido flojo en una solución acuosa, ocupando una gran cantidad de espacio, por lo que puede unirse más de 1.000 veces su propio peso en agua [3].

Dependiendo de la fuente yMétodo de extracción del ácido hialurónicoSu masa molecular relativa (Mr) es de 8×105 a 5×106[4]. La estructura y la actividad biológica del ácido hialurónico dependen de su masa molecular relativa. El ácido hialurónico de bajo peso molecular forma una red fragmentada a bajas concentraciones, mientras que el ácido hialurónico de alto peso molecular forma una red completa [3].

Debido a los enlaces de hidrógeno dentro de la molécula,Moléculas de ácido hialurónicoAdoptar una estructura de héúnica en solución acuosa [5]. Cuando la concentración de ácido hialurónico en la solución alcanza un cierto nivel, las moléculas de ácido hialurónico interactúan entre sí para formar una estructura de doble hé, y una estructura de red se forma a concentraciones más altas [3]. La teoría actualmente aceptada de la estructura del ácido hialurónico es la teoría de la estructura terci, que establece que cada unidad de trisacárido en una molécula de ácido hialurónico tiene una región hidrofóbica. Cuando la concentración de la solución es alta, las regiones hidrofóbicas de las moléculas de ácido hialurónico interactúan para formar una estructura de doble hé, que es la base para la agregde las moléculas de ácido hialurónico [6].

Ácido hialurónicoSe caracteriza por su muy alta visco[2]. A bajas concentraciones o bajas masas moleculares relativas, la viscode la solución cambia poco con el aumento de la concentración o Mr. Cuando la viscoalcanza 10 mPa·s después del aumento de la Mr y la concentración, las moléculas de ácido hialurónico comienzan a entrelaz, momento en el cual la viscoaumenta rápidamente con el aumento de la Mr y la concentración [3].

2 tecnología de producción de polvo de ácido hialurónico

Hay tres técnicas de producción reportadas para polvo de ácido hialurónico, a saber, extracción, fermentación microbiana y síntesis [1].

El método de extracción implicaExtraer ácido hialurónicoDe tejidos humanos o animales [1]. El método de extracción fue el primer método utilizado para producir ácido hialurónico. Actualmente, las principales materias primas utilizadas en la producción son los peines de pollo, el cordón umbilical humano y los ojos de animales. Las principales etapas del proceso incluyen extracción, eliminación de impurezas, hidrólisis enzim, precipitación y separación. Los procesos de extracción y purificación del ácido hialurónico de diferentes tejidos difieren hasta cierto punto [3]. Sin embargo, debido a la limitada fuente de materias primas para el método de extracción, la tasa de extracción del producto es extremadamente baja (sólo alrededor del 1%), y el proceso es complejo, por lo que es difícil reducir los costos de producción. Además, debido a que el ácido hialurónico se combina con otras sustancias altamente moleculares en el tejido animal, es más difícil de separar y puri, y los productos de ácido hialurónico extraídos del tejido animal pueden causar infección. Estos factores limitan la amplia aplicación del método de extracción en industrias como la medicina y la cosmética [2,3].

El método sintético consiste en sintetizar primero un"Derivado de oxaziridina del ácido hialurónico"Usando una macromolécula biológica, luego agregando agua e hialuronidasa de los testículos de ovejas o vacas para preparar un complejo del derivado y la enzima, y finalmente quitando la enzima para purificar el ácido hialurónico [1]. El método sintético se encuentra todavía en fase de investigación en laboratorio y aún no ha sido aplicado a la producción industrial [1].

El método de fermentación microbiana se refiere al uso de bacterias analizadas para llevar a cabo la fermentación y el cultivo, y el producto de ácido hialurónico se obtiene aislándolo y purificándolo del caldo de fermentación [1]. Debido a las desventajas anteriores del método de extracción y el hecho de que el método sintético aún no está maduro, el método de fermentación microbiana se ha convertido en el método más importante paraProduciendo ácido hialurónico. El siguiente es un resumen más sistemático del método de fermentación microbiana para la producción de polvo de ácido hialurónico.

2.1 cría de bacterias productoras de ácido hialurónico

El microorganismo más temprano descubiertoProducir ácido hialurónicoFue Streptococcus pyogenes, que fue descubierto en 1937 para ser capaz de producir ácido hialurónico [7]. Posteriormente, en 1939, se descubrió que Streptococcus equisimilis y S. zooepidemicus también eran capaces de producir ácido hialurónico [7]. Dado que los estreptococos de tipo silvestre pueden producir ácido hialurónico,  Equisimilis) y Streptococcus zooepidemicus (S. zooepidemicus) también se encontró que era capaz de producir ácido hialurónico [7].

Desde el estreptode tipo salvaje tiene desventajas tales como la capacidad de producir hialuronidasa, expresar otras proteínas extracelulares, yBajo ácido hialurónicoProducción [2], las cepas silvestres deben modificarse por diversos medios en la producción real para satisfacer las necesidades de la producción industrial.

2.1.1 Mutagenesis cría

Los mutágenos incluyen principalmente mutágenos físicos, mutágenos químicos y mutágenos biológicos. En la actualidad, los mutágenos utilizados en la cría deCepas productoras de ácido hialurónicoIncluyen principalmente luz ultravioleta, rayos de 60Co γ y nitroguanidina (NTG) [7]. Muchos informes de investigación han demostrado que al tratar algunas cepas originales que pueden producir ácido hialurónico, como Streptococcus zooepidemicus y Streptococcus equi, con varios tratamientos mutagénicos, se pueden obtener excelentes cepas con alta producción de ácido hialurónico, o ácido hialurónico de peso molecular relativamente alto, o reacciones negativas después del pre-tratamiento con hialuronidasa, o no hemóli, o una combinación de las características anteriores [7].

2.1.2 cultura Protoplast

Dado que los protoplastos no tienen paredes celulares, son más sensibles a los cambios en las condiciones ambientales que las células normales y responden más fuertemente a los tratamientos mutagénicos [7]. Se han llevado a cabo experimentos exitosos utilizando mutágenos químicos como NTG o mutágenos físicos como láseres para tratar protoplastde cepas originales para obtener cepas de alto rendimiento [7].

2.1.3 ingeniería genética

El gen que codifica la enzima implicada en elSíntesis de ácido hialurónicoVía en Streptococcus se encuentra en una sola transcriptasa inversa y se llama el has operon. En Streptococcus pyogenes, el operon has consta de tres genes: hasA (1248 BP), que codifica ácido hialurónico sintasa (42.0 U), hasB (1204 BP), que codifica udp-glucosa deshidrogenasa (47.0 U), y hasC (915 BP), que codifica udp-glucosa pirofosforilasa (33.7 U) [2]. Aunque aún no está claro cómo las cadenas de ácido hialurónico son transportadas a través de la membrana celular, la expresión de ácido hialurónico sintasa y udp-glucosa deshidrogenasa en Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Bacillus subtilis es suficiente para dirigir la producción y transporte de ácido hialurónico [2]. Por lo tanto, el ácido hialurónico puede ser producido simplemente mediante la transferencia de los genes hasA y hasB en la célula huésped y teniéndolos expresado en la célula huésped [7].

El gen de síntesis HA de la cepa de GAS mucos43/192/4 del grupo A de Streptococcus agalactiae fue clonado y construido por primera vez en un plásmido de Escherichia coli en 1993, y expresado con éxito en E. coli para sintetizar HA [8]. Posteriormente, el gen de síntesis HA de Streptococcus agalactiae grupo C fue clonado y expresado en E. coli en 1997 [8].

Ling Min et al. [9] amplificó el gen sqhas del ADN total de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, construyó un plásmido de expresión y lo transformó en E. coli DH5α, expresó con éxito la proteína sqHAS, y sintetizha en presencia de un sustr. Zhang Jinyu et al. [10] clonaron el gen hasB de Streptococcus zooepidemicus y lo expresaron en E. coli para obtener la proteína correspondiente.

El grupo de investigación Chien en la provincia de Taiwán de China introdujo los genes hasA y hasB de Streptococcus zooepidemicus en Lactococcus lactis a través del sistema de expresión inducible NICE, y obtuvo con éxito una cepa de ingeniería queProduce ácido hialurónico[11].

Sheng Juyu[12] introdujo el gen sintasa de Streptococcus zooepidemicus hyaluronan en Lactococcus lactis a través del sistema de expresión inducible NICE (nisin-controlled gene expression system) y lo expresó con éxito para sintetizar HA.

2.2 optimización de las condiciones de fermentación

Los estreptococos son bacterias con requerimientos nutricionales exigentes que necesitan crecer en medios ricos en nutrientes. Los estreptococos usualmente crecen en medios complejos que contienen una mezcla de levadura o extractos animales, peptona y suero. La formulación de estos medios siempre incluye glucosa (10-60 g/L), aminoácidos, nucleótidos, una gran cantidad de sal, oligominerales y vitaminas [2].

El pH y la temperatura son muy importantes para el crecimiento de Streptococcus zooepidemicusProducción de ácido hialurónico. Algunos estudios han demostrado que las condiciones de pH 6,7 ± 0,2 y temperatura 37 ± C son las más adecuadas para el crecimiento de Streptococcus zooepidemicus y la producción de ácido hialurónico [13]. La velocidad de agitación también afecta a la producción de ácido hialurónico. Estudios han demostrado que bajo condiciones de bajas tasas de agitación, la producción de ácido láces alta y la producción de ácido hialurónico es baja [13]. La agitación a alta velocidad puede reducir el efecto de la síntesis de ácido lácy aumentar la producción de ácido hialurónico, pero también puede destruir los polímeros de ácido hialurónico y reducir su masa molecular relativa [13]. La concentración inicial de glucosa tiene un efecto significativo sobre la masa molecular relativa del ácido hialurónico. La investigación muestra que cuando la concentración inicial de glucosa se incrementa de 20 g/L a 40 g/L, la masa molecular relativa del ácido hialurónico también aumenta de (2.1 − 0.1) − 106 a (3.1 − 0.1) − 106 [13].

Liu et al. [14] informaron que durante la fermentación por lotes de Streptococcus zooepidemicus, se agregperóxido de hidrógeno (1,0 mmol/g HA) y ácido ascórbico (0,5 mmol/g HA) a las 8 y 12 h, respectivamente, para causar la reacción redoxDespolimerización del ácido hialurónicoEsto resultó en una disminución en la masa molecular relativa y el rendimiento aumentó de 5.0 g/L a 6.5 g/L.

3 aplicaciones de ácido hialurónico

Debido a los muchosPropiedades del ácido hialurónicoMencionado anteriormente, ha sido ampliamente utilizado en muchos campos. Lo siguiente resume principalmente la aplicación del ácido hialurónico en cosméticos, productos de salud y campos médicos y farmacéuticos.

3.1 aplicación de ácido hialurónico en cosméticos

Ácido hialurónicoSe encuentra principalmente en la matriz extracelular entre las células, donde tiene la función de mantener el espacio extracelular de las células de tejido, acelerando el flujo de nutrientes, y el mantenimiento del tejido. En primer lugar, en comparación con los humectantes tradicionales, el ácido hialurónico tiene un mejor efecto hidratante y tiene las ventajas de no ser graso y no obstruir los poros. En segundo lugar, una solución acuosa de ácido hialurónico tiene una fuerte viscoelasy lubricidad, que ayuda a formar una película hidrattranspirable sobre la superficie de la piel para mantener la piel hidratada. En tercer lugar, pequeñas moléculas de ácido hialurónico pueden entrar en la dermis, promover la microcirculación sanguínea, y ayudar a la piel a absorber nutrientes, que pueden tener un efecto cosméy promotor de la salud. Finalmente, el ácido hialurónico puede eliminar los radicales libres activos de oxígeno en la piel causados por la radiación ultravioleta, proporcionando protección solar y reparación [15].

Debido a los muchosVentajas del ácido hialurónicoEs ampliamente utilizado en cosmética como el factor hidratante natural ideal para hidratar, emoliente, antiarruy protector solar. La cantidad usual de adición es de 0.05% a 0.50% [15].

3.2 aplicación de ácido hialurónico en productos sanitarios

desdeEl ácido hialurónico tiene varias propiedadesComo la retención de agua, la lubric, la promoción de la cicatride heridas y la protección de las células, una disminución en el ácido hialurónico en el cuerpo puede conducir a muchos problemas como la artritis, el envejecimiento de la piel, y el aumento de las arrugas. Por lo tanto, la suplementación oral de ácido hialurónico para complementar el ácido hialurónico endógeno se considera actualmente como una de las formas eficaces para mantener la belleza y la salud y prolongar la vida [16].

La base teóricaÁcido hialurónico oralEs que después de la digestión oral, el ácido hialurónico puede aumentar los precursores para la síntesis de ácido hialurónico en el cuerpo, aumentando así la cantidad de ácido hialurónico sintetizen en el cuerpo y dirigila a los tejidos como la piel para ejercer su efecto. En la actualidad se han lanzado diversos productos de ácido hialurónico oral, como tabletas, cápsulas y líquidos orales [16].

3.3 aplicación de ácido hialurónico en tratamiento médico

El ácido hialurónico es ampliamente utilizadoEn oftalmología, ortopedia y muchos otros campos médicos debido a su viscoelasúnica, biocompatibilidad y no-inmunogeni[17].

Para las enfermedades oculares, la vía de tratamiento preferida es la administración oftálmica tópica. Para los fármacos oftálmicos, la biodisponibilidad del fármaco se correlaciona positivamente con la viscodel líquido dentro de un cierto rango. El aumento de la viscopuede prolongar el tiempo de residencia del fármaco en el ojo y así mejorar la eficacia. Sin embargo, algunos potenciadores de viscopueden causar efectos secundarios como molestias en los ojos. El ácido hialurónico supera este inconveniente debido a sus propiedades de fluido no newtoniy buena biocompatibilidad. Por lo tanto, es un buen fármaco oftálmico viscoviscoque vale la pena desarrollar y aplicar [18]. Además de usarse en gotas para los ojos, el ácido hialurónico también puede usarse para tratar los síntomas del ojo seco. Actualmente, el ácido hialurónico se ha utilizado junto con una variedad de otros polímeros de alto contenido molecular para mejorar los síntomas del ojo seco [19].

Además de su presencia en el cuerpo vítreo, el ácido hialurónico es también el principal componente del cartílago articular y líquido sinovial. Cuando el cuerpo desarrolla osteoartritis, artritis reumatoide y otras enfermedades articulares, la producción y el metabolismo del ácido hialurónico en la articulación es anormal, y la concentración y el peso molecular relativo del ácido hialurónico en el líquido sinovial se reducen significativamente, lo que altera la degradación del cartílago. Esto ha llevado al desarrollo de la terapia complementaria viscoelástica, que trata enfermedades articulares porComplementar con ácido hialurónico exógeno. Esta terapia se está volviendo cada vez más popular entre los médicos y pacientes por igual debido a su eficacia a largo plazo y pocos efectos secundarios [20].

Además, el ácido hialurónico también es ampliamente utilizado en los sistemas de administración de fármacos como diversos portadores (tales como portadores de fármacos antitumdirigidos, vectores no virales para la terapia génica, y portadores depéptidoComo materiales de implante en cirugía, y en el tratamiento de úlceras orales recurrentes [17].

4 perspectivas

Como el ácido hialurónico se está aplicando gradualmente en diversos campos, el método de fermentación microbiana para la producciónPolvo de ácido hialurónicoGradualmente sustituirá el método de extracción y se convertirá en el principal método para la producción industrial de ácido hialurónico. El inicio de la producción de ácido hialurónico en un huésped extranjero indica que la producción de ácido hialurónico ha entrado en la etapa de aplicación de la biotecnología moderna. En el futuro se seleccionarán cepas que puedan producir ácido hialurónico con diferentes masas moleculares relativas, y mediante la optimización continua de las condiciones de fermentación se proporcionarán productos de ácido hialurónico que puedan ser utilizados en diferentes campos. El ácido hialurónico también se usará cada vez más ampliamente en muchos campos.

Referencias:

[1] Ling Peixue. Investigación y aplicación del ácido hialurónico [M]. Pekín: People's Medical Publishing House, 2010. 1- 6.

[2] CHONG B F, BLANK L M, MCLAUGHLIN R, et al. Producción de ácido hialurónico microbiano [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(4): 341-351.

[3] Liu Long. Control de procesos y optimización de la producción de ácido hialurónico por la fermentación de Streptococcus zooepidemicus [D]. Wuxi, Jiangsu: universidad Jiangnan, 2009.

[4] Jiang Qiuyan, Ling Peixue, Lin Hong, et al. Estudio sobre la degradación térmica del ácido hialurónico [J]. China Pharmaceutical Industry Journal, 2006, 37(1): 15-16.

[5] STERN R, ASARI A A, SUGAHARA K N. Hyaluronan fragments: An information-rich system [J]. Eur J Cell Biol, 2006, 85(8): 699-715.

[6] BARBUCCI R, LAMPONI S, BORZACCHIELLO A, et al. Hidrogel de ácido hialurónico en el tratamiento de la osteoartritis. Biomaterials, 2002, 23(23): 4503-4513.

[7] Shi Yanli, Guo Xueping, Luan Yihong. Resumen de la cría de bacterias productoras de ácido hialurónico [J]. Food and Drugs, 2006, 8(10): 22-24.

[8] Zheng Xueling, Wang Fengshan, Ling Peixue. Progreso de la investigación de la sintasa del ácido hialurónico [J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2004, 11(6): 413-416.

[9] Ling Min, Huang Ribo, Huang Kun, et al. Clonación Molecular y expresión del gen de la sintasa del ácido hialurónico de Streptococcus equi subsp. Zooepidemimicus [J]. Microbiología Industrial, 2003, 33(2): 4-8.

[10] Zhang Jinyu, Wu Xiaoming, Hao Ning, et al. Clonación y caracterización del gen relacionado con la síntesis de ácido hialurónico hasB de Streptococcus zooepidemicus [J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2005, 25(7): 86-91.

[11] CHIEN L J, LEE C K. hialurronic acid production by recombinant Lactococcus lactis [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 77(2): 339-346.

[12] Sheng J. establecimiento de la vía de síntesis del ácido hialurónico en Lactococcus lactis y estudio preliminar sobre el mecanismo de regulación de la masa molecular relativa del ácido hialurónico microbisintetiz[D]. Jinan: universidad de Shandong, 2009.

[13] SHI Y L, WANG F S, GUO X P, et al. Encuesta de investigación sobre la producción de hialuronan por fermentación [J]. The Proceedings of The China Association for Science and Technology, 2006, 2(4): 268-271 (en inglés).

[14] LIU L, DU G C, CHEN J, et al. Producción microbiana de ácido hialurónico de bajo peso molecular mediante la adición de peróxido de hidrógeno y ascorbato en cultivo batch de Streptococcus zooepi- demicus [J]. Bioresource Technology, 2009, 100(1): 362-367.

[15] Guo Fengxian, Ling Peixue, Guo Xueping, et al. Funciones fisiológicas del ácido hialurónico y su aplicación en cosméticos y alimentos de belleza y salud [J]. China Business Industry, 2002 (9): 45-46.

[16] Song Yongmin, Guo Xueping, Luan Yihong, et al. Nuevo recurso alimentario - ácido hialurónico [J]. Food and Drugs, 2009, 11(5): 56-59.

[17] Wan Xiuyu, Ling Peixue, Zhang Tianmin. Nuevos avances en la investigación y aplicación del ácido hialurónico [J]. Food and Drugs, 2006, 8(12): 1-3.

[18] Ling Peixue, Guan Huashi, Rong Xiaohua, et al. Progreso de la investigación sobre los sistemas de administración de fármacos oftálmicos [J]. Chinese Journal of Pharmacy, 2006, 41(1): 7-9.

[19] Ling Peixue, Zhang Tianmin, Li Qi, et al. Avances en la aplicación e investigación del ácido hialurónico en fármacos oftálmicos [J]. Chinese Medicine and Clinical, 2004, 4(9): 697-699.

[20] Ling Peixue, He Yanli, Zhang Qing. Efecto terapéutico del ácido hialurónico en la osteoartritis [J]. Food and Drugs, 2005, 7(1): 1-3.