¿Cómo obtener la vainilina Natural del ácido ferúlico?

Resumen: la vainillina es la tercera especia comestimás grande del mundo, y con la mejora de people' s dosis de vainilina natural aumenta de año en año. En este trabajo, Streptomyces psammoticus OMK-4 fue utilizado como la bacteria fermentadora para la producción de vanillina, y las condiciones de fermentación se trazaron y optimien un fermentde reposición automática de 30 l. Las condiciones óptimas de fermentación se determinaron a través de la optimización de la cantidad de inóculo, temperatura de incub, pH de incub, oxígeno disuelto y otras condiciones de fermentación, y la potencia fue tan alta como 25.3 g/L. Los resultados fueron los siguientes:

La vainillina, científicamente conocida como 4-hidroxi3-metoxibenzaldehído, se encuentra en el bálsamperuano, el aceite de raíz de clavo, la vainilla, el café, las uvas y el brandy, y tiene un olor a vainilla y un sabor dulce [1-3]. La vainillina es un sabor importante que puede usarse como potenciador de aromas, agente aromatizante, armonizador y potenciador de aromas en alimentos, tabaco, cosméticos y agricultura.  Debido a su amplia gama de aplicaciones, la demanda anual de vainillina está creciendo a una tasa del 10%, pero la producción nacional sigue siendo insuficiente para satisfacer la demanda del mercado nacional e internacional [4-5].

La vanilina puede ser producida por síntesis química, extracción, biotransformación y métodos enzim[6]. Con el aumento de personas y#39;s conciencia de la salud, la demanda y el precio de la vainillina natural han estado aumentando continuamente, y se ha convertido en un tema de investigación candente en los últimos años [7]. Sin embargo, la cantidad limitada de vainillina natural extrade las plantas está lejos de satisfacer la demanda del mercado, y la carga ambiental causada por la síntesis química es cada vez más pesada, por lo que la bioconversión y los métodos enzimse han convertido en la fuerza principal en la producción de vanillin [8-9].

En este trabajo se adopta el método de bioconversión aProducir vainilina a través del metabolismo microbi.Con ácido ferúlico como sustr, el cual tiene ciclo corto, alto rendimiento y menor contaminación, y luego de optimizar las condiciones de fermentación, están disponibles las condiciones para la industrialización.

1 materiales y métodos

Cepas de ensayo 1.1

Streptomyces psammoticus OMK-4 fue depositado en la sala de cepa de Xiamen Omicron Biotechnology Co.

1.2 instrumentos principales

30 L automatic Refill fermenter, Shanghai Baoxing Biotechnology Co., Ltd; Cromatolíquida de alto rendimiento (HPLC), Agilent, 1260 Ⅱ; Biosensor, Academia de ciencias de Shandong, SBA-40E; Espectrofotómetro, Shimadzu, UV-1780; PH meter, Mettler, S-210S.

1.3 medios de comunicación culturales

Medios de cultivo

Almidón Soluble 1.0~3.5 g/L, fosfato de dihidrógeno de potasio 0.1~0.5 g/L, urea 0.1~0.3 g/L, sulfato de magnesio 0.05~0.10 g/L, carbonato de calcio 0.1~0.3 g/L, levadura en polvo 0.1~1.0 g/L, jarabe de maíz 0.1~1.0 g/L, sulfato de amonio 0.1~0.6 g/L, ácido ferúlico 0.2 g/L.

Medios de fermentación 1.3.2

Almidón Soluble 2.0~5.0 g/L, fosfato de dihidrógeno de potasio 0.1~0.3 g/L, urea 0.1~0.5 g/L, sulfato de magnesio 0.05~0.1 g/L, carbonato de calcio 0.5~2.0 g/L, extracto de levadura 0.1~1.0 g/L, sulfato de amon0.1 ~0.5 g/L, y ácido avic 2.0 g/L. Los siguientes son algunos ejemplos del almidón soluble utilizado en la preparación de la muestra.

1.4 métodos de cultivo

1.4.1 cultivo de semillas

Bajo condiciones asépticas, se utilizó la espátula de inoculación para insertar un anillo completo de cepas bien crecidas de la inclinación sólida cultivada en el medio de semilla estéril, el pH inicial del medio de semilla fue de 5~8, y los organismos fueron cultivados hasta la etapa de crecimiento logarítmico en condiciones de temperatura de incubde 28~35 ℃ y velocidad de rotación de 200~500 r/min.

1.4.2 cultivos fermentadores

El líquido de la semilla cultivado hasta la fase de crecimiento logarítmico se añadió al medio de fermentación en condiciones asépticas a un volumen de 5%~15%; El pH inicial del medio de fermentación fue de 7,2 ~ 7,8, y la fermentación se llevó a cabo durante 70~120 h en condiciones de temperatura de 30~40 ℃, velocidad de batide de 200~500 r/min, y la tasa de aireación de 1 − 0,5. La fermentación se llevó a cabo en las condiciones de 1 − 0,5, y la fermentación se llevó a cabo en las condiciones de 1 − 0,5.

1.5 optimización de las condiciones de fermentación

1.5.1 efecto del pH sobre la fermentación de la vainillina

El pH del proceso de fermentación no sólo afecta a la existencia del sustr, sino que también se correlaciona con la presión osmótica de las células, que afecta a la entrada y salida del sustrdentro y fuera de las células. Con el fin de obtener el pH óptimo de fermentación, se investigó el efecto de diferentes controles de pH sobre la potencia de la vanillina, y los métodos específicos fueron los siguientes: (1) se controló que el pH de todo el proceso de fermentación fuera 7,5; (2) se controló que el pH del proceso de fermentación fuera de 7,5 para 0-12 h, y luego se controló que el pH del proceso de fermentación posterior fuera de 8,0;

(3) el pH se controló a 8,0 durante todo el proceso de fermentación.

1.5.2 efecto del oxígeno disuelto sobreFermentación de vainilina

Los experimentos han demostrado que el control del oxígeno disuelto en el caldo de fermentación tiene una gran influencia en el crecimiento de las bacterias y la acumulación de los productos en la etapa posterior, por lo tanto, es necesario controlar el oxígeno disuelto en el proceso de fermentación. Con el fin de obtener el control óptimo del oxígeno disuelto en la fermentación, se investigaron los efectos de diferentes controles de oxígeno disuelto sobre el crecimiento de bacterias y la acumulación de productos. Se realizaron los siguientes experimentos: 0%, 10%, 20%, 30%, 40% y 50% del oxígeno disuelto fue controlado por velocidad de rotación y aireación, respectivamente.

1.5.3 efecto de la temperatura de incubsobre la fermentación de la vanilina

La temperatura tiene un efecto importante sobre la producción microbiana, la síntesis y la acumulación de metabolitos. La temperatura elevada puede acelerar el crecimiento y el metabolismo de los microorganismos, pero una temperatura demasiado alta también puede conducir a la disminución prematura del organismo y afectar a la acumulación de productos. Por lo tanto, es importante optimizar la temperatura de la deformación [10]. Con el fin de obtener la temperatura óptima de cultivo por fermentación, se investigó el efecto de diferentes temperaturas de cultivo en el crecimiento de las bacterias, y se comparó el crecimiento de las bacterias y la acumulación de vanillina mediante el control de las temperaturas a 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃ y 40 ℃, con el fin de obtener el método de control óptimo de temperatura. 

1.5.4 efecto de la cantidad de inóculo sobre la fermentación de la vainillina

Diferentes cantidades de inóculo tienen efectos importantes sobre el crecimiento normal y el metabolismo de las bacterias, muy poco inóculo llevará a un crecimiento lento de las bacterias, el período de retraso del crecimiento de las bacterias será más largo, y la complejidad de los metabolisecundarios no es propicio para la acumulación de los productos posteriores; Un exceso de inóculo llevará al crecimiento excesivo de las bacterias, y el medio aumentará el agotamiento de nutrientes, y el oxígeno disuelto no será capaz de cumplir con los requerimientos de control [11]. Por lo tanto, es importante controlar la cantidad de inóculo fermentado. Para obtener el nivel óptimo de inóculo de fermentación, se investigaron los efectos de diferentes niveles de inóculo sobre el crecimiento de bacterias, y se comparó el crecimiento de bacterias y la acumulación de vanilina mediante cinco gradide niveles de inóculo de 1%, 3%, 5%, 7% y 9%, para obtener el nivel óptimo de inóculo.

1.6 métodos de análisis

Determinación de la concentración bacteriana: tomar la solución de cultivo y diluirlo con agua destildurante un cierto número de veces, luego mezclarbien y medir la absorbancia a 620nm con un espectrofotómetro.

Determinación del azúcar residual: Ferrin&#Se utilizó la titulación de reactivo 39;s [12]. Determinación del contenido de vanilina: HPLC [13].

2 resultados y discusión

2.1 efecto del pH sobre la fermentación de la vanilina

Como se muestra en la Fig. 1, el crecimiento de la bacteria fue mejor a pH 7.5, con el máximo OD620 de 0.62; El crecimiento de la bacteria fue peor a pH 8.0, con el máximo OD620 de 0.41; Y el crecimiento de la bacteria fue mejor a pH 7.5 para 0-12 h, con la máxima OD620 de 0.64 en el control posterior de 8.0. Por lo tanto, el crecimiento de las bacterias fue facilitado por el pH 7,5, y el crecimiento de las bacterias era más lento cuando el pH era más alto. Cuanto más alto es el pH, más lento es el crecimiento de la bacteria. A partir del control de pH segment, se puede observar que el crecimiento de las bacterias no se vio afectado cuando el pH se ajusta 8.0 en la etapa posterior, por lo que las bacterias habían alcanzado básicamente la etapa de estabilización a las 12 h de fermentación.

De la Fig. 2 se puede observar que la concentración de vanilina fue de 13.200 g/L, 16.988 g/L y 14.500 g/L bajo diferentes controles de pH, y la tasa de conversión de vanilina fue la más alta a pH 7,5 de 0 a 12 h, y luego a pH 8,0, seguida de pH 8,0, y fue más pobre a pH 7,5, lo que puede deberse a que la actividad enzimfue mejor que la de pH 7,5 a pH 8,0. Esto puede deberse al hecho de que la actividad enzima a pH 8.0 fue mejor que a pH 7.5.

Combinando las figuras 1 y 2, se puede resumir que el crecimiento de la bacteria fue mejor a pH 7,5, y la tasa de conversión enzimfue mayor a pH 8,0. Por lo tanto, se eligió que el control de segmentdurante la fermentación ayudaría al crecimiento de las bacterias y obtendría una mejor actividad enzimática.

2.2 efecto del oxígeno disuelto en la fermentación de la vanilina

Como puede verse en la Fig. 3, con el aumento del oxígeno disuelto, la concentración de bacterias fue aumentando, en el que el crecimiento de bacterias fue el peor en 0% de oxígeno disuelto, básicamente no hay crecimiento de bacterias; Al 40%~50% de oxígeno disuelto, era la condición óptima de crecimiento para las bacterias, y el crecimiento de las bacterias era el más alto, y la OD620 era 0.75. En el caso de aumentar el oxígeno disuelto, el tiempo para que las bacterias entren en el período de crecimiento logarítmico disminuye gradualmente, y cuando el oxígeno disuelto alcanza el 40%~50%, el período de adaptación para el crecimiento de las bacterias es el más corto, y las bacterias pueden entrar en el período de crecimiento logarítmico rápidamente, acortando así el ciclo de fermentación. Por lo tanto, se puede juzgar que el crecimiento de las bacterias necesita una gran cantidad de suministro de oxígeno, y el crecimiento de las bacterias es mejor cuando el nivel de oxígeno disuelto es de 40%~50%.

De la Fig. 4, se puede observar que la acumulación de vanilina mostró un aumento gradual y luego una disminución lenta con el aumento del oxígeno disuelto, y la mejor acumulación de vanilina se encontró en alrededor del 30% del oxígeno disuelto, y la acumulación más alta fue alrededor de 17,5 g/L. La baja acumulación de vanillin a oxígeno disuelbajo puede ser debido a la pobre producción de las bacterias, la enzima insuficiente o la condición de oxígeno disuelbajo que afecta la vitalidad de la enzima. Con el aumento gradual del oxígeno disuelto, la acumulación de vanillin mostró gradualmente una tendencia decreciente, especialmente al 50% de oxígeno disuelto, la disminución de vanillin se produjo en la última etapa de la fermentación, y se encontró que la acumulación de ácido vanillic como un subproducto aumentó gradualmente, lo que se sospecha que se debe al exceso de oxígeno disuelto que condujo al flujo del metabolismo hacia la producción de ácido vanillic. Se sospecha que el nivel de oxígeno disuelto es demasiado alto, lo que conduce al sesdel flujo metabólico hacia la producción de vanilina. Por lo tanto, el nivel de oxígeno disuelto no debe ser demasiado elevado en la fase de producción de vainilina para evitar que afecte al índice global de conversión.

Como puede verse en las Figs. 3 y 4, el control del oxígeno disuelto en el proceso de fermentación fue seleccionado para ser controlado en etapas, en las cuales el oxígeno disuelto fue controlado en 40%~50% en la etapa de crecimiento bacteriano para asegurar la acumulación del volumen de bacterias y acortar el ciclo de crecimiento de las bacterias, y el oxígeno disuelto fue controlado en 30% en la etapa de producción de vanillina para asegurar la rápida acumulación del producto.

2.3 efecto de la temperatura de incubsobre la fermentación de la vanilina

De la Fig. 5, se puede ver que el crecimiento de las bacterias era lento cuando la temperatura era baja, y la concentración de las bacterias era más y más alta con el aumento de la temperatura de incub, y la concentración de las bacterias era la más alta cuando la temperatura alcanzó alrededor de 35 ℃, y la OD620 alcanzó 0,73; Sin embargo, la concentración de las bacterias comenzó a disminuir con el aumento de la temperatura a 40 ℃, que fue probablemente debido a la destrucción del metabolismo normal de las bacterias por la alta temperatura.

Como puede verse en la Fig. 6, con el aumento gradual de la temperatura, la tasa de conversión de vanillin fue más y más alta, y los efectos de conversión fueron de 35 ℃, 30 ℃, 40 ℃ y 25 ℃ en el orden de magnitud; De acuerdo con el cálculo de la tasa de conversión de cada bacteria, las temperaturas óptimas fueron 40 ℃, 35 ℃, 30 ℃ y 25 ℃ en el orden de magnitud. Las temperaturas óptimas fueron 40 ℃, 35 ℃, 30 ℃ y 25 ℃. Se puede ver que la tasa de conversión de vanillina era más y más alta con el aumento gradual de la temperatura, y la tasa de conversión de vanillin a temperaturas más altas era mejor que la de vanillin a temperaturas más bajas.

Comparando las figuras 5 y 6, se puede observar que el efecto de la temperatura sobre la fermentación y conversión de vainilina de la cepa OMK-4 fue mayor, y se eligió la temperatura de 35 ℃ para el cultivo de la cepa y conversión de vanilina.

2.4 efecto de la cantidad de inóculo en la fermentación de vanilina

En la Fig. 7 podemos ver los efectos de diferentes cantidades de inóculo sobre la concentración final de bacterias, cinco diferentes cantidades de inóculo pueden alcanzar una concentración de alrededor de 0,7, de las cuales el 1% del inóculo tiene un efecto peor, la concentración más alta es sólo alrededor de 0,65.  En las primeras 10 h, con el incremento dela cantidad de cepa, el periodo de retardo de fermentación fue obviamente acortado, comparando con 1% y 9%, el periodo de retardo fue obviamente acortado en cerca de 6 h. De la Fig. 8, se puede ver que 9% del inóculo fue más efectivo que 1% del inóculo. De la Fig. 8, se puede ver que la cantidad de inóculo de 9% era obviamente peor que las otras cuatro cantidades de inóculo, probablemente debido al hecho de que las bacterias fueron suministrprincipalmente en el proceso de cultivo y la vitalidad de la enzima se reduciría con el aumento de la concentración de las bacterias. Por lo tanto, la cantidad de inóculo no debe ser demasiado grande en el proceso de inoculación. Comparando la cantidad de inóculo de 1%, 3%, 5% y 7%, la tasa de conversión de vanillin fue ligeramente mayor que las otras cuatro cantidades de inóculo, y la mayor cantidad de conversión fue 17.21 g/L, 17.23 g/L, 18.05 g/L y 17.27 g/L. Considerando los resultados de las Figs. 7 y 8, finalmente se seleccionó la cantidad óptima de inóculo de 5%.

3 conclusión

Las condiciones óptimas de fermentación obtenidas a partir de la optimización del fermentador de recarga automática 30L fueron: pH 7,5 y oxígeno disuelto 40%~50% de 0 a 12 h, y luego pH 8,0 y oxígeno disuelto 30%; La temperatura de fermentación fue de 35 ℃ durante toda la fermentación, y la cantidad de inóculo fue de 5%. La temperatura de fermentación fue de 35 ℃, y la cantidad de inóculo fue de 5%. La fermentación se realizó en las condiciones óptimas para 36 h, y la potencia final de vanillin fue tan alta como 25,3 g/L, lo que fue un buen resultado en el experimento piloto.

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