¿Qué es Rebaudioside A?

El alto consumo de azúcar en lundietundiaria es uno de los factores que causan obesidad. Las enfermedades cardiovasculares causadas por la obesidad, como la hipertensión, la hiperglucemia y la diabetes, seluna importante crisis de salud pública que afecta la salud humana en todo el mundo [1].La Stevioside es un edulcorsencaloríasExtraído de las hojas de la planta de stevia, y es conocido como uno de los "world'stres fuentes principales de azúcar "junto con el azúcar de caña y el azúcar de remolacha [2]. El stevioside en las hojas de la planta de stevia es una mezcla de moléculas con diferentes estructuras, principalmente incluyendo stevioside (St), rebaudioside a (Reb a), rebaudioside D (Reb D) y rebaudioside M (Reb M)[3]. Reb A), rebaudioside D (Reb D), y rebaudioside M (Reb M), etc.[3]. La dulzura de la steviosida es de 250 a 350 veces la de la sacarosa, y puede reemplazar a la sacarosa como una nueva generación de fuente de azúcar natural sencalorías [4].

Desde la década de 1990, las organizaciones reguladoras de alimentos y medicamentos en muchos países de Europa y los Estados Unidos han evaluado la seguridad de la stevioside y aprobado por unanimidad de alta pureza (- 95%)Stevioside como edulcorseguro[5]. En los últimos años, algunos ensayos clínicos han demostrado que la stevioside no sólo puede ser utilizado como un edulcor[6], sino que también tiene una variedad de beneficios para la salud, tales como anti-diabetes, bajar la presión arterial, cardiotónico, anti-inflamatorio, antibacteriano, anti-tumor y así por delante [7].

Estas propiedades promotoras de la salud han dado stevioside una demanda más amplia del mercado. Los investigadores han desarrollado actualmente una variedad de nuevos métodos para extraer y sintetizar esteviósido, que han promovido en gran medida la producción y aplicación de esteviósido [8 − 10]. Este documento describe la seguridad y la demanda del mercado de la stevioside, resume la aplicación de la stevioside en los campos de productos alimenticios y de salud, y proporciona una perspectiva sobre laExtracción de plantas y biosíntesis de stevioside, sentando una base teórica para la investigación en profundidad y la producción industrial de stevioside.

1. La seguridad de la stevioside y la demanda del mercado

A finales de 1980, elSeguridad de steviosideFue ampliamente cuestion, por lo que los países lanzaron investigaciones sobre la seguridad de la stevioside. En 1995, la administración de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos (FDA) aprobó la stevia para su uso en suplementos dietéticos [5]. En 2008, 2013y 2014, Reb A, Reb D y Reb M fueron reconocidos sucesivamente como generalmente reconocidos como seguros (GRAS) por la FDA [11 − 12]. Posteriormente, la seguridad de los glicósidos de estefol fue reconocida sucesivamente por el comité mixto FAO/ OMS de expertos en aditivos alimentarios (JECFA) [13], el Food Standards Australia New Zealy(FSANZ) [14], la autoridad europea de seguridad alimentaria (EFSA) [15], y la autoridad de seguridad alimentaria y normas de la India (FSSAI) [16]. FSANZ) [14], autoridad europea de seguridad alimentaria (EFSA) [15], y autoridad de seguridad alimentaria y normas de la India (FSSAI) [16]. En 2011, los departamentos competentes de China aprobaron oficialmente el uso de la stevioside como aditivo alimentario en bebidas, conservas de frutas, condimentos, pasteles y otros alimentos [3].

China is the world& (en inglés)#39;s Mayor productor de glicósidos de stevia. Según la asociación China Stevia, en 2009, China's área de cultivo de stevia era de cerca de 16.667 hectáreas, distribuidas principalmente en Xinjiang, Gansu, Mongolia interior, Hebei, Jiangsu, Anhui, Heilongjiang y otros lugares, con una producción anual de cerca de 40.000 toneladas de materias primas de stevia [17]. La producción de glucóside de estevia se ha promovido plenamente en más de 27 provincias y ciudades. Alrededor del 80% de la stevioside producida en China se exporta a más de 20 países, incluyendo Japón, Corea del sur, los Estados Unidos y Malasia. China es actualmente el world's mayor exportador de stevioside[18]. Además, países y regiones como Rusia, India, Canadá, Sudáfrica y Kenia también tienen diferentes áreas de cultivo para la promoción del cultivo [19 × 21].

Actualmente, stevioside se ha convertido en the world's edulcornatural de alta intensidad más ampliamente utilizado con cero calorías.La estevioside puede mejorar el equilibrio energéticoY ayudar en el control de peso. Según las estadísticas de la asociación internacional de Stevioside, en 2016, alrededor de 3.000 productos alimenticios y de bebidas que contienen Stevioside fueron lanzados en todo el mundo, y el número de consumidores ha superado los 4 mil millones [22]. En 2017, el número de productos alimenticios que usaban stevioside como aditivo edulcorexcedió el número de aquellos que usaban aspartamo como edulcor. Productos, y el número de personas que los consumen ha superado los 4 mil millones [22]. En 2017, el número de productos alimenticios que usaban glucóside de estevia como edulcorsuperó el número de productos que usaban aspartamo como edulcor[23]. Se estima que para el año 2027 el consumo mundial de polvo de steviosida alcanzará las 10.254,93 toneladas con un crecimiento anual de 7% a 8% [24].

Reb A es la stevioside más utilizada en el mercado. De enero de 2015 A febrero de 2017, el precio del Reb A de alta pureza (± 95%) subió de 73.000 USD/ tonelada A 77.300 USD/ tonelada [23]. En 2017, el mercado global alcanzó los 417 millones de dólares. Con el avance de la tecnología y el desarrollo de una nueva generación del edulcornatural Reb M, se espera que para 2024 las ventas del mercado de stevia crezcan a una tasa anual del 8,2%, alcanzando los 721 millones de dólares [25]. Según informes relevantes de investigación de mercado, el mercado global de stevioside tenía un valor de 620,8 millones de dólares estadounidenses en 2020, y se espera que llegue a 1,14 millones de dólares estadounidenses en 2028, con una tasa de crecimiento anual compuesto (CAGR) del 8,0%. [24], y la tasa de crecimiento anual compuesto podría alcanzar el 8,5% en 2030, con un tamaño de mercado de 16,428 mil millones de dólares [26].

2 Steviol glucósidosapplications (en inglés)

2.1 los glucósidos de estevia como edulcorantes

Los glicósidos de eviolpueden usarse en alimentosEn diferentes proporciones como aditivo alimentario [27] porque todavía mantienen un buen sabor cuando se usan en combinación con otros edulcorantes. Con la seguridad de los glicósidos de esteviol siendo reconocida, los glicósidos de esteviol han sido ampliamente utilizados en el mercado. Las formas comunes de glicóside de esteviol son los polvos, tabletas y líquidos, que pueden ser utilizados como edulcorantes naturales en alimentos como bebidas, cerveza, productos de panadería, delicatessen, alimentos conservados, frutas y verduras procesadas, condimentos, alimentos congelados, salsas, aperiy cereales [6].

En 2013, Coca-Cola comenzó a producir bebidas que contienen estevia, reduciendo su contenido calórico en un 30% [28]. En 2018, Coca-Cola lanzó una cola de stevia que reemplaza completamente el azúcar blanco con glucóside de stevia, cambiando el sentimiento dulce y graso traído por el azúcar blanco y reemplazándolo con una dulzura dulce y deliciosa. Aunque satisface la necesidad de dulzura, también alcanza una glicación baja [29].La steviosida puede reducir la viscodel sustr.En algunos escenarios de aplicación, como cambiar la viscodel vino de frutas para hacerlo más sabroso, y aumentar el efecto espumante de la cerveza para hacer la espuma densa y de larga duración [30].

elUso de glicósidos de esteviol en lugar de sacarosa en productos horneadosPuede reducir la tasa de fermentación de la masa y el volumen del pan, y mejorar el valor nutricional del pan mediante la reducción del índice glucémico y el contenido energético [31]. Las galletas de avena preparadas con diferentes proporciones de extracto de stevia para reemplazar a la sacarosa fueron evaluadas por sus propiedades sensoricomo apariencia, sabor, olor y textura. Los resultados mostraron que las galletas preparadas con 25% y 50% de sacarosa sustitupor extracto de stevia eran las más populares entre los consumidores [27].

En la producción de jalea y mermelada, la adición de azúcar no solo afecta el dulzor final, sino que también ayuda a aumentar los sólidos solubles totales [32]. El azúcar en geles de gelatina o mermelcon agua o un hidrogel. Cuando los glucóside de estevise se utilizan para reemplazar completamente la sacarosa, la gelatina no se fija correctamente y la apariencia se ve afectada. Cuando la sucralosa,El esteviósido y el agar se usan juntosEl contenido calórico de la jalea y la mermelpuede ser reducido [33-34].

Los glucóside de Steviase pueden utilizar para reemplazar la sacarosa en senazúcarDulces elaborados con ñame, dragón, papaya, guay, kiwi y nueces como nueces, maní y piñón. Además de proporcionar nutrición mineral, también satisfacen a los consumidores#39; Deseo de dulzura [35]. Reemplazar la sacarosa en el chocolate con glucóside de estevino solo produce chocolate sin azúcar con un sabor similar al original, satisfacia a las personas#39;s gusto, pero también reduce el riesgo de posible aumento de peso y enfermedades del metabolismo del azúcar [36]. Además, los glicósidos de esteviol no son utilizados por los microorganismos. La sustitución de la sacarosa por glucóside de estevien los pickles y las verduras encuradas puede controlar la proliferación de microorganismos y prevenir su deterioro durante la fermentación [37].

2.2 funciones saludables de los glicósidos de esteviol

La Stevioside no sólo actúa como edulcorante, pero también tiene una variedad de actividades biológicas y beneficios para la salud, tales como anti-diabético, anti-fibrosis cardíaca, anti-hígado graso, anti-inflamatorio, antibacteriano, y propiedades anti-tum[7]. Dado que el metabolifinal de las diferentes esteviosidas es todo esteviol, el esteviol no se acumula en el cuerpo, haciendo que las esteviosidas sean seguras para su uso como productos para la salud sin causar ningún efecto secundario tóxico [38].

Steviol glucósidos Steviol, Steviol glucósido, stevioside, rebaudioside ASe utilizaron estachydrine y Reb A para alimentar A ratones diabéticos tipo 2 inducidos por estreptozotocina. En comparación con los ratones diabéticos tipo 2 no tratados, los ratones diabéticos tipo 2 alimentados con derivados de steviside tuvieron un aumento significativo de la secreción de insulina, un metabolismo mejorado de la glucosa en el hígado, se aceleró el glucógeno hepático acelerado, se redujeron la concentración de glucosa en sangre y los niveles de hemoglobina glicada (HbA1c), y se mejoró la diabetes en ratones [39].

Después de 6 semanas de alimentar a ratas de hígado graso con 75 a 150 mg/kg de St, el grado de hígado graso en el grupo experimental de ratas se redujo significativamente, indicando que el St puede disminuir los lípidos sanguíneos [40]. El St se utilizó para alimentar a ratones con coliulcerativa inducida por sulfato de dextransódico, ratones con shock letal inducido por lipopolisacárido (LPS), y ratas con artritis adyuvindupor Freund's adyuvcompleto (ACF). Se encontró que el TS puede inhibir la liberación de factores pro-inflamatorios, aumentar la producción de citocinas antiinflamatorias y reducir significativamente las respuestas inflamatorias [41]. (Freund's adyuvcompleto, FCA) inducido por artritis adyuven ratas, se encontró que el St puede inhibir la liberación de factores proinflamatorios, aumentar la producción de citocinas antiinflamatorias y reducir significativamente la respuesta inflamatoria [41-43].

La Stevioside tiene una eficacia evidente en la fibrosis anticardíacaAntibacteriy antitumorAl.Después de la fibrosis miocárdica inducida por isoproterenol en ratones fue tratada oralmente con st durante 40 días, el mice&#Los niveles de hidroxiprolina miocárdica y el índice de peso cardíaco disminuyeron, y el grado de fibrosis miocárdica se redujo significativamente [44]. 20 mg/mL de st puede inhibir el crecimiento de Escherichiacoli. Ajustar la concentración de st puede inhibir el crecimiento de Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, etc. efecto inhibit[45]. Reb A puede auto-ensamben en micelas. La formulación de Reb A y honokiol (HK) en micelas autoensamblreb A → HK puede mejorar la biodisponibilidad oral de HK y mejorar su actividad antitumorAl.Por lo tanto, la steviosida tiene un gran potencial en la administración de fármacos antitumorales hidrofóbicos [46]. Los glucóside de esteviol también pueden eliminar especies reactivas de oxígeno como los radicales hidroxilo y superóxido, y se puede utilizar para tratar enfermedades como la hipertensión, diabetes tipo 2, aterosclerosis y tumores.

3 métodos de preparación de los glucósidos de esteviol

3. 1 planta extracción de glicósidos de esteviol

Métodos tradicionales deExtracción de glucóside de estevi.Las plantas de las plantas incluyen la extracción con agua caliente, extracción por solvente, maceración y adsoren resinas macroporosas [47 − 50]. Estos métodos no sólo son lentos y labori, sino también relativamente inefici, y consumen excesivos disolventes y energía [51]. Con el desarrollo de la biotecnología moderna, los investigadores han desarrollado una variedad de métodos para extraer glicósidos de estevia natural.

La extracción asistida por microondas (MAE) puede utilizar energía de microondas para promover la transferencia de stevioside al solvente. Comparado con la técnica tradicional de maceración, este método tiene una temperatura de operación óptima más baja y el tiempo óptimo de extracción se acorta a 1/7 del método de maceración [49]. La extracción con fluido supercrítico (SFE) no solo es más eficiente que las técnicas tradicionales de maceración, sino que también reduce las emisiones de dióxido de carbono y el consumo de disolventes [52].

La extracción asistida por ultrasonido (UAE) utiliza principalmente la vibración ultrasónica para romper células y liberar sustancias intracelulares. Comparado con otras técnicas de extracción, este método tiene una temperatura de extracción más suave [53]. Los Reb A y St extraídos mediante extracción dinámica rápida sólido líquido (RSLDE) son líquidos incolory transparentes, mientras que el producto extraído mediante el método de macertradicional es de color amarillo oscuro. El método RSLDE no sólo aumenta la producción de stevioside, sino que también reduce los pasos de purificación del producto subsecuentes, por lo tantoReducir el costo de producción de stevioside[54]. Los métodos de extracción mencionados se encuentran todavía en fase de investigación de laboratorio y es necesario seguir investigando para reducir el coste de la aplicación industrial [49,53].

el content desteviol yrebaudioside A inLas hojas de Steviason las más altas, representando del 5% al 10% y del 2% al 4% del peso seco de las hojas[55]. Por lo tanto, los principales componentes de los productos obtenidos por las técnicas de extracción existentes son el steviol y rebaudioside A. Reb D y Reb Los M están presentes en las hojas de estevia en niveles extremadamente bajos, representando sólo 0,4 — 0,5% del peso seco de las hojas, por lo que es ineficiy costoso extraer directamente Reb D y Reb M de estevia [9,56].

3. 2 biosíntesis de stevioside

La extracción directa de steviosida de las plantas es a menudo afectada por el contenido de steviosida y el ciclo de crecimiento de la planta. En los últimos años, los investigadores han utilizado técnicas tales como la secuenciación del genoma y expresa etiquetas de secuencia (ESTs) para revelar las principales vías de síntesis de stevisisidos en stevia natural [10,57], sentando las bases para la producción heteróloga deSteviosides using synthetic Biology (en inglés).Los estudios han demostrado que la principal diferencia entre los diferentes tipos de glicósidos de estol radica en el número y la posición de los grupos de azúcar, lo que resulta en diferente dulzura y sensación en la boca [58]. El trisacárido St y el tetrasacárido Reb A son de 250 A 300 veces más dulces que la sacarosa, con un ligero regusto [59]; El pentasacárido Reb D y el hexasacárido Reb M son 350 veces más dulces que la sacarosa, con casi ningún regusto y un mejor sabor [9].

El principalVía sintética de Reb D y Reb MEn la stevia es como sigue: el steviol es catalizado por las glicosiltransferasas SrUGT85C2 y SrUGT74G1 para transferir el grupo de glucosa de la glucosa uridinedifosfato donante de azúcar (udp-glucosa) al grupo c13-hidroxidel esqueleto de esteviol a través de un enlace − -D-glucoside. Glucosa (glucosa uridinedifosfato, UDPG) a los grupos funcionales c13-hidroxilo y c19-carboxilo del esqueleto de esteviol a través de un enlace − -d-glucósido para formar rubusosido (Rub) [60]; El grupo C13 glicosil de rubusosido forma un enlace 1,2- − - d-glicosídico bajo la catálisis de la glucosil transferasa SrUGT91D2 para formar St[61]; El grupo c13-glucosil de St forma un enlace 1,3- − -d-glicosídico bajo la catálisis de la glucosil transferasa SrUGT76G1 cataliza la formación de un enlace 1,3- − -d-glicosídico para generar Reb a [56]; El grupo glucosil en la posición C19 de Reb A es catalizado sucesivamente por SrUGT91D2 y SrUGT76G1 para generar Reb D y Reb M (figura 1) [61].

TheBiotransformation destevioside (en inglés)Actualmente es la forma más rentable de lograr la producción industrial de stevioside. La biotransformación de la steviosida incluye principalmente: (1) la construcción de una vía de síntesis de la steviosida en los microorganismos mediante la sobreexpresión de los genes glicosiltransferasa para sintetizar heterólogamente la steviosida utilizando glucosa como fuente de carbono; (2) síntesis de esteviosida usando biocatálisis.

3. 2. 1 The de novo synthesis of stevioside (en inglés)

Construir la vía de producción del ácido mevalónico (MVA) en Escherichia coli, y luego introducir un módulo terpenque contiene los genes para la geranilo difosfato sintasa, ciclopentapropanoil difosfato sintasa y kaureno sintasa, un módulo de citocromo P450 que contiene los genes para diaglycolate oxid, kaureno 13α -hidroxilasa y citocromo P450 reductasa, y 13α -hidroxilasa y citocromo P450 reductasa, así como un módulo de glicosiltransferasa compuesto por las glicosiltransferasas SrUGT85C2, Sr UGT91D2w, SrUGT74G1 y SrUGT76G1, la cepa obtenida SSY10 pSY447 puede sintetizar 10.03 mg/L de Reb A desde cero en un plazo de 5 días [61].

Una vía sintética deSteviol to Reb MEl mutante UGT76G1 Leu257Gly produjo cuatro veces más Reb D que UGT76G1, y los mutantes UGT76G1 Lys337Pro y UGT76G1Thr55Lys produjeron cerca de 4 veces más Reb M que UGT76G1. Fue 4 veces mayor que UGT76G1. Los mutantes UGT76G1 Lys337Pro y UGT76G1Thr55Lys tenían una mayor capacidad para producir Reb M en un 20%, y la producción de subproductos como Reb G y Reb Q casi se elimin[9].

En comparación con los métodos tradicionales de extracción de plantas y síntesis química, la síntesis de novo de diseño artificialLos glucósidos de esteviol pueden producir glucóside de esteviol específicoEn la ruta prevista en un menor tiempo y de una manera respetuosa con el medio ambiente. Sin embargo, debido a que la síntesis de novo de glicósidos de esteverol por los microorganismos implica muchas etapas de reacción catalítica, los niveles de expresión de enzimas en los microorganismos para algunos pasos clave son bajos, y la actividad es pobre, lo que resulta en rendimientos generalmente bajos de glicósidos de esteverol.

3. 2. 2 biocatalític synthesis of stevioside (en inglés)

La ComisiónLa síntesis de stevioside se refiere al proceso de usar enzimasO microorganismos productores de enzimas como catalizadores para la síntesis de esteviosida. SteviaUGT76G1 puede catalizar la producción de Reb A A partir de St[9]. La glicosiltransferasa UGT76G1 se expresa en la superficie de la Pichia pastoris GS115 utilizando la proteína de anclgcw61p. La cepa recombinutiliza St como sustr, UDPG como donante de glicosil, catálisis de células completas para generar Reb a, la tasa de conversión es de 70,37% [62]. El UDPG es caro, con el fin de reducir el costo de la catálisis, los investigadores co-expresaron la Arabidopsis sacarosa sintasa AtSUS1 y el soru GT76G1 fue co-expresado en E. coli. La solución enzimcrude de AtSUS1 catalizó la conversión de sacarosa y difosfato de uridina (UDP) A UDPG, y la enzima recombinsrugt76g1 catalizó la síntesis de Reb A usando St como sustr[58]. Este método utiliza UDP y sacarosa de bajo costo como sustrpara sintetizar las UDPG in situ, reduciendo aún más el costo de producción industrial de la stevioside (figura 2) [11,58].

SteviarebaudianaUGT91D2 canCatalizar la producción de Reb D A partir de Reb A[10]. Sin embargo, actualmente no hay investigación sobre la enzima recombinsrugt91d2. Los investigadores expresaron la glucosiltransferasa de tomate UGTSL2 en E. coli, y la enzima recombinfue capaz de catalizar la producción de Reb D y Reb M2 A partir de Reb A como sustr[63]. Reb M2 es un isómero de Reb M, y su seguridad no ha sido verificada [16].

Una mayor mutagenesis de saturde UGTSL2 resultó en el mutante Asn358Phe, que tuvo un aumento del 21,9% en la actividad catalítica, pero una pequeña cantidad de Reb M2 todavía estaba presente en el producto [64]. 9%, pero una pequeña cantidad de Reb M2 todavía estaba presente en el producto [64]. La glicosiltransferasa EUGT11 de arroz (Oryza sativa) fue expresada en Escherichia El coli:y Pichia pastoris para obtener cepas recombinantes XE − 3 y BL21 (pET28a~ − OsEUGT 11). La enzima recombineugt11 expresada por XE − 3 tiene la mayor actividad en la catalización de laProducción de Reb DA 45 °C en un buffer de fosfato sódico a pH 6.0-6.5 con UDPG como donante de azúcar. La enzima recombineugt11 expresada por BL21 (pET28a-OsEUGT11) tiene la mayor actividad catalítica a 35 °C en el buffer Tris HCl a pH 8.5 [65].

La EUGT11 recombinexpresada en Pichia pastoris tiene mayor resistencia a los ácidos y estabilidad térmica que la enzima recombinexpresada en Escherichia coli [65]. Se utilizó una estrategia de control de temperatura de dos pasos desarrollada utilizando un diseño ortogonalOptimizar la producción de Reb DEn la cepa XE − 3. La cepa recombinde XE − 3 se cultivó en medio BMMY conteniendo 0,75% de metany pH 5 de medio BMMY ~ (medio complejo memetanbuf) a 28 iC por 3-4 d para obtener una proteína diana de aproximadamente 790 mg/L de OsEUGT11. Posteriormente, Reb A y la UDPG donante de azúcar fueron añadial cultivo bacteriano, y las células enteras de la cepa recombinxe − 3 catalizaron la producción específica de Reb D A partir de Reb A 35 ⁃ C para 4 D, con un rendimiento de 93.47%.

Este método simplifica los pasos de separación y purificación de proteínas (Fig. 3) [65]. Con el fin de descubrir nuevas glicosiltransferasas con mayor actividad, los investigadores combinmétodos de bioinformática, tales como la comparación de secuencias de homología, análisis de dominio y simulación de estructura terci, para detectar glucosyltransferasas CaUGT de Capsicum annuum y StUGT de Solanum tuberosum. Se expresaron en Escherichia coli, tanto las enzimas recombinantes, CaUGT y StUGT, pueden utilizar UDPG como un donante de azúcar para catalizar la conversión de Reb a a Reb D. Sin embargo, el producto catalítico de la enzima recombincaugt contiene el subproducto Reb M2, mientras que la enzima recombinstugt puede catalizar específicamente la conversión de Reb a a Reb D con un rendimiento de 97% [66].

Aparte de SrUGT76G1, ninguna otra glicosiltransferasa se ha encontrado para catalizar la conversión de Reb D a Reb M. SrUGT76G1 recombinexpresado en Escherichia coli puede catalizar elConversión de Reb D a Reb M con una tasa de conversión del 72,2%[67]. El mutante SrUGT76G1T284S aumentó la conversión de Reb D a Reb M en aproximadamente un 50% [68]. SrUGT76G1 expresado en E. coli es propenso a formar cuerpos de inclusión, lo que afecta a la producción eficiente de glicosiltransferasas [65]. Los investigadores fusionaron una corta etiqueta de péptido ácido en el terminal C de SrUGT76G1 para obtener cuatro enzimas de fusión de cola ácida, que mejoraron el nivel de expresión soluble, la estabilidad térmica y la actividad catalítica de SrUGT76G1 en E. coli. La enzima de fusión ácido C-terminal tiene 202,46% de la actividad del tipo salvaje cuando cataliza la producción de Reb M usando Reb D y UDPG como sustren un tampón de hidróxido de glicina-sodio a pH 9,0 [69].

Con el fin de catalizar la producción directa de la stevioside de alto valor de sustrmás baratos, acortar el tiempo de reacción, y reducir los costos de producción, los investigadores han desarrollado un sistema de cascada de múltiples enzimas. Cuando OsEUGT11, SrUGT76G1, y la Arabidopsis sintasa de sacarosa AtSUS3 son co-expresadas, las bacterias recombinantes puedenCatalizar directamente la producción de Reb M A partir de Reb AUDP y sacarosa como sustr[68]. La mutación del gen que codifica SrUGT76G1 en la bacteria recombinante de modo que la treonina en la posición 284 se muta a una serina aumenta la proporción de los productos catalizados de células enteras Reb M y Reb D de 1:3.9 a 7:1, reduce la proporción del producto intermedio Reb D, y aumenta el rendimiento de Reb M [68]. La tecnología de inmovilización enzimpuede aumentar la reutilización de enzimas y reducir el coste de las reacciones enzimáticas.

Usando glutaraldehído como agente reticuly quitosano como transportador, OsEUGT11 y SrUGT76G1 expresados en Escherichia coli fueron Unidos covalentemente a microesferas de quitosano, respectivamente, lo que puede mejorar la estabilidad de almacenamiento y la reutilización de las enzimas recombinantes. Sin embargo, la producción de Reb M está limitada por el costoso sustrato Reb D. Para directamenteGenerar Reb M desde el barato Reb AEn un solo paso, los investigadores construyeron una reacción en cascada inmovilizando simultáneamente OsEUGT11 y SrUGT76G1 en quitosano. La enzima coinmovilizobtenida utiliza UDPG como donante de azúcar. En un buffer de fosfato sódico a pH 7,0 con 3 mmol/L MgCl2, el Reb a puede ser catalizado directamente para generar Reb M, que es 3,2 veces más activo que el sistema mixto de inmovilización individual (figura 4).

En resumen, la tecnología biocatalítica es sencilla de operar, tiene alta especificidad catalítica y produce pocos subproductos, lo que facilita la posterior separación y purificación del producto, facilitando así la producción industrial de glicósidos de esteviol [70].

4 resumen y perspectivas

Como un nuevo tipo deEdulcornatural sin calorías, el valor alimenticio y medicinal de la steviosideTambién se está explorando continuamente. En 2018, Reb D y Reb M, que son incluso más dulces, recibieron una amplia atención y se espera que sustitua Reb A como una nueva generación de edulcorantes naturales. Sin embargo, el contenido de Reb D y Reb M en stevia es extremadamente bajo, y el costo de extracción y purificación de las plantas es alto, lo que limita su aplicación y desarrollo.

La biosíntesis de la stevioside es una manera importante para promover la producción eficiente de Reb D y Reb M. en el futuro, la eficiencia de la biosíntesis de la stevioside se puede mejorar de las siguientes maneras: (1) el número y la actividad de las glicosiltransferasas existentes son limitadas. La bioinformática se puede utilizar para descubrir nuevos tipos de glicosiltransferasa de alta eficiencia, y utilizar la tecnología de modificación molecular para mejorar el nivel de expresión, la eficiencia catalítica y la estabilidad térmica de la enzima recombinante; (2) utilizar la tecnología de la biología sintética para construir vías para sintetizar Reb D y Reb M a partir de glucosa en células microbianas como Escherichia coli, y mejorar el rendimiento de Reb D y Reb M mediante la regulación de redes metabólicas relacionadas, el desarrollo y la optimización de elementos reguladores de genes, etcRendimiento de R e b D y R e b M; (3) desarrollar tecnologías de inmovilización, catálisis de células completas, cascadas multienzimáticas y regeneración de coenzimas para reducir los costes de producción, acelerando así la aplicación comercial de la steviside.

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